高発現のセンダイウイルスベクター SeV Packaging System

• SeV Packaging Systemについて
• 製品ラインナップ
• 操作方法概略
• SeVベクター作製例
• 参考文献
• ご注文方法
• 価格

SeV Packaging Systemについて

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製品ラインナップ

キット内容	品名	SeV Packaging System
		Starter Pack 1	Starter Pack 2
	商品コード	S-0010	S-0011
Vero-F	C-0001	●	●
SeV Packaging Mix	M-0001-10	●	●
pSeV Vector	G-0010	●	●
pSeV(MHN)mEmerald Vector	G-0011	−	●

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操作方法概略

1. pSeVベクタープラスミドへ目的遺伝子をクローニングする。
2. 1.でクローニングしたpSeVベクタープラスミドを調製する。
3. Vero-F細胞を播種する（Vero-F細胞はトランスフェクション当日にコンフルエントになるように前日に播種する^*1）。
4. pSeVベクタープラスミド、およびSeV Packaging MixをVero-F細胞へトランスフェクション（37℃培養）する。
5. トランスフェクション翌日にトリプシン（終濃度 2.5 μg/ml）を添加した無血清培地で培地交換（32℃培養）を行う（毎日トリプシン添加無血清培地で培地交換）。
6. SeVベクター上清を回収する（トランスフェクションから3～4日後）。

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＜以下は拡大産生の手順＞

7. SeVベクターの拡大産生（Vero-F細胞に感染し、トリプシン添加無血清培地で培地交換を行う（32℃培養））。
8. SeVベクター上清を回収する（種ウイルス^*2感染から2～4日後）。

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pSeV ベクタープラスミドへの目的配列のクローニング

• 重要1：センダイウイルスを含むパラミクソウイルスのゲノムはゲノム塩基の総数が6の倍数でなければ複製することができません。このパラミクソウイルスの性質はrule of 6と呼ばれています。例えば、センダイウイルスの野生株は15,384塩基（6の倍数；6×2,564）ですが、その前後の15,383、15,385塩基や、3の倍数であっても6の倍数でない15,381塩基では、ゲノムの複製を行えなくなります。塩基長の調整は本来の終止コドンの後ろに終止コドンを加えるなど任意の塩基を追加することで調整可能です。


• 重要2：センダイウイルスの転写にはRNA依存性RNAポリメラーゼが用いられ、EIS配列という独自の制御配列が必要です（EIS：転写終止配列（9塩基）、介在配列（3塩基）、転写開始配列（10塩基））。搭載遺伝子の下流に22塩基からなるEIS配列（TAAGAAAAACTTAGGGTGAAAG）を必ず付加して下さい。EIS配列を挟むことで複数遺伝子の同時搭載も可能です。A、B、Cの3種類の遺伝子を搭載する場合はA-EIS-B-EIS-C-EISのように配列を準備して下さい。搭載遺伝子からのタンパク質の翻訳にはEIS配列とは別に開始コドンと終止コドンが必要です。EIS配列で挟む遺伝子毎に開始コドンと終止コドンがあることを確認して下さい。これらの遺伝子発現量はA>B>Cの順になります。


• 重要3：pSeVベクタープラスミドへのクローニング位置はN遺伝子の手前の+（プラス）位やP遺伝子とM遺伝子の間のPM位、HN遺伝子とL遺伝子の間のHNL位と後ろに搭載するに従って発現量が低下します。+位に搭載することで最も発現量が向上しますが、P遺伝子の前に長い遺伝子を配置するとセンダイウイルスの複製に影響を与えます。2,000塩基以上を搭載する場合はPM位に搭載して下さい。遺伝子発現を抑えたい場合はHNL位に搭載して下さい。



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• 補足1：センダイウイルス搭載遺伝子にもコザック配列（Kozak sequence）やコドンの最適化が有効です。poly A配列は不要です。


• 補足2：搭載遺伝子の塩基配列内にEIS配列（特に転写終止配列）と類似の配列＊3 がある場合やフレームシフトを生じやすい配列＊4が存在する場合はサイレント変異を導入して下さい。例えば、搭載遺伝子内にリジンをコードするAの連続AAA/AAAが存在する場合は、AAG/AAAやAAG/AAGなどのようにサイレント変異を導入して下さい。サイレント変異の導入により、SeVベクターの産生効率や転写効率の低下を避けることができます。


• ＊3 SeVの転写終止配列はTAAGAAAAAですが、WAHVAAAAAも終止配列として機能する可能性があります（W：A or T、H：A or T or C、V：A or C or G）。
• ＊4 X/XXZ/ZZNのような配列がフレームシフトを生じやすい配列です。フレームシフトを生じる具体的な例としてA/AAA/AAG配列があります。このA/AAA/AAG配列はSeVの配列中P遺伝子のみに存在し、RNA編集によりPタンパク質とは読み枠の異なるVタンパク質が翻訳されます。

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SeVベクター作製例

SeVベクター作製例（pSeV(MHN)mEmerald）（12ウェルプレート）

SeVベクターの拡大産生例（pSeV(MHN)mEmerald）（12ウェルプレート）

SeVベクターの拡大産生例（pSeV(MHN)mEmerald）（T25フラスコ）

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参考文献

1. Garcin, D., et al., "A highly recombinogenic system for the recovery of infectious Sendai paramyxovirus from cDNA: generation of a novel copy-back nondefective interfering virus.", EMBO J., 14(24), 6087～6094 (1995). [PMID：8557028]
2. Calain, P., and L. Roux., "The rule of six, a basic feature for efficient replication of Sendai virus defective interfering RNA.", J. Virol., 67(8), 4822～4830 (1993). [PMID：8392616]
3. Kolakofsky, D., et al., "Paramyxovirus RNA Synthesis and the Requirement for Hexamer Genome Length: the Rule of Six Revisited.", J. Virol., 72(2), 891～899 (1998). [PMID：9444980]
4. Sharma, V., et al., "Analysis of tetra- and hepta-nucleotides motifs promoting-1 ribosomal frameshifting in Escherichia coli.", Nucleic Acids Res., 42(11), 7210～7225 (2014). [PMID：24875478]
5. WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5-WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance（）
6. Morimoto, S., et al., "Intranasal Sendai virus-based SARS-CoV-2 vaccine using a mouse model.", Genes Cells, 28(1), 29～41 (2023). [PMID：36401755]

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ご注文方法

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価格

SeV Packaging System（Starter Pack）

別売品

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