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定量PCRを用いたメチル化DNA測定キット OneStep PLUS qMethyl PCR Kit

掲載日情報:2024/10/09 現在Webページ番号:71783

リアルタイムPCRで測定するメチル化DNA定量キットです。バイサルファイト(亜硫酸水素塩)処理が不要で、SYBR GreenおよびTaqManプローブに対応しています。複数のステップを必要とする従来の手順とは異なり、DNA試料の添加から測定までワンステップで行えるので、迅速かつ正確な測定が可能になります。

製品外観

特長

  • DNAのバイサルファイト(亜硫酸水素塩)処理は、不要です。
  • 標的ゲノム領域の正確なメチル化DNA定量をリアルタイムPCRで行います。
  • 単一遺伝子座および多遺伝子座の迅速なDNAメチル化スクリーニングに最適です。
  • SYBR GreenおよびTaqManプローブに対応しています。
  • 最適なDNA量:20 ng / 5 μl(有効範囲:5 ng~1 μg / 5 μl)
  • 用いるDNAの純度:A260 / A280>1.8、A260 / A230>1.8
  • 対応機器:CFX-96、CFX Opus 96(Bio-Rad社)、QuantStudio qPCR Systems(Thermo Fisher Scientific社)、LightCycler 480(Roche Diagnostics社) など

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測定原理

同じDNA試料について、Test反応Reference反応を並行して分析します。Test反応は、非メチル化DNAを選択的に分解するメチル化感受性制限酵素(MSRE)を加えるため、次の工程のリアルタイムPCRではメチル化DNAのみが増幅されます。一方、Reference反応は、MSREが含まれていないため、メチル化DNAと非メチル化DNAの両方が増幅されます。メチル化率は、Percent Methylation = 100×2-ΔCt で求めます。ΔCt値は、Test反応からReference反応のCt値を引いた数値になります。

測定原理

非メチル化CpG部位とメチル化CpG部位を白丸と黒丸で表記している。図Cと図Dは、ヒト非メチル化DNAスタンダードとメチル化DNAスタンダードから得られた増幅曲線の例。図CのTest反応のCt値がReference反応のCt値より高いので、非メチル化DNAフラクションがメチル化感受性制限酵素(MSRE)反応中に分解されたことを示している(画像をクリックすると拡大表示します)。


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FAQ

別の蛍光色素や分子プローブを使用することもできますが、選択した色素にお手持ちのリアルタイムPCR装置が適合しているかを確認して下さい。

あらゆる生物種のゲノムDNAに適応します。A260 / A230比は約1.8、260 / 280比は約1.8をおすすめします。不純物の多いDNAは、DNA Clean & Concentrator-5 Kit(#D4013)を使用してクリーンアップして下さい。

ターゲットが150 bp以上の長さになるように、プライマー設計して下さい。また、試料がcfDNAの場合は、50 ng以上用いて下さい。

ターゲットのプライマーは通常の方法で設計できますが、最適なアニーリング温度を決定するために条件検討を行って下さい。qMethyl Control Primer Ⅰ&Ⅱのアニーリング温度は56~64℃です。58℃が最適なアニーリング温度になります。

MSRE反応(30℃で12時間)は、インキュベーター内でも行えます。2~24時間の範囲で検証をしていますが、12時間が最適です。

使用可能です。ROXをオフにしたプロトコルで検証しています。

二重標識TaqManプローブを用いたマルチプレキシングで検証しています。TaqManプローブを使用することで、同一反応内で複数のターゲットを測定できます。


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キット内容

  • 2×Test PreMix
  • 2×Reference PreMix
  • Fluor dye(SYBR Green Filterと互換性があります)
  • qMethyl control primer Ⅰ&Ⅱ
  • Human methylated DNA standard
  • Human non-methylated DNA standard
  • DNase / RNase free water

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[在庫・価格 :2025年04月25日 20時55分現在]

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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