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近接ライゲーション法(PLA)を用いた新型コロナウイルスの膜タンパク質検出キット SARS-CoV-2 Membrane Protein Proximity Ligation Assay(PLA)Kit(Cy3)

掲載日情報:2023/01/24 現在Webページ番号:71152

ウイルス感染した組織またはウイルス感染/トランスフェクションした細胞(セルブロック)から新型コロナウイルスの膜タンパク質を検出するキットです。ウイルス膜タンパク質はPLA(Proximity Ligation Assay)プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドが結合した一次抗体ペアを用いて検出します。この一組のPLAプローブが膜タンパク質に近接して結合した時のみ生じる増幅シグナルを利用して、特異的かつ高感度に検出します。

近接ライゲーションアッセイ(PLA)とその測定原理について

近接ライゲーションアッセイ(PLA)とは?

近接ライゲーションアッセイ(PLA:Proximity Ligation Assay)は、単一分子の高解像度解析における内在性のタンパク質、タンパク質間相互作用およびタンパク質の翻訳後修飾を検出する高感度で特異的なツールです。PLAは相補的なオリゴヌクレオチドが結合した抗体ペアを用いて、標的タンパク質をdual recognitionする原理に基づいています。コネクターオリゴヌクレオチドを一緒に加えることにより、2つのオリゴヌクレオチドが環状DNAを形成し、この環状DNAがローリングサークル増幅(RCA:Rolling Circle Amplification)反応のテンプレートとして働きます。存在量の少ないタンパク質や、特定のタンパク質間相互作用やタンパク質修飾などのレアイベントからの弱いシグナルは、in situでRCAにより1,000倍以上へ増幅できるため、PLA は特異的かつ高感度な研究および診断ツールとなります。接着細胞または組織切片試料を用いてPLAを行うことができます。

PLAの測定原理

theory

  1. 試料を2つのPLAプローブとインキュベーションすることで、プローブが目的とするタンパク質のエピトープに結合する。
  2. 長鎖および短鎖のコネクターオリゴヌクレオチドを試料に加え、2つのPLAプローブが近接(<40 nm)してエピトープに結合すると、コネクターオリゴヌクレオチドを介してオリゴがハイブリダイズし、環状一本鎖DNAを形成する。
  3. 環状DNA上の2つのコネクターオリゴヌクレオチド間のギャップはDNAリガーゼにより埋められ、閉環する。
  4. PLAオリゴヌクレオチドの一つがプライマーとなり、閉環した環状DNAがローリングサークル増幅(RCA:Rolling Circle Amplification)反応のテンプレートとして働く。
  5. RCAにCy3蛍光色素標識のオリゴヌクレオチドプローブを加えハイブリダイズさせる。得られたシグナルは蛍光顕微鏡を用いて明るい蛍光スポットとして検出される。


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特長

  • 新型コロナウイルス感染した組織/細胞の膜タンパク質を特異的かつ高感度に検出します。
  • 測定試料:細胞、組織
  • アッセイ法:Proximity Ligation Assay(PLA)
  • アッセイ数:5アッセイ
  • 検出方法:蛍光

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操作方法概略

本キットを使用する際は、必ず製品プロトコルをご確認下さい。

  1. 反応に用いる領域の画定
    ・スライドガラス用疎水性ペンやシリコンワックスを用いて、スライド上の試料(切片)を取り囲む。
  2. ブロッキング
    ・Blocking solutionで試料(切片)を覆うように十分量滴下し、スライドを湿潤箱に入れ、室温で30分間インキュベートする。
  3. PLAプローブのインキュベーション
    ・Antibody (Ab)-Oligo A,B(PLA抗体溶液)をBlocking solutionで100倍希釈し、Blocking solutionを除去したスライドに滴下した後、湿潤箱に入れ、4°Cで一晩インキュベートする。
  4. ライゲーション
    ・スライドからPLA抗体溶液を除去し、Wash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからWash bufferを除去する。
    ・洗浄中にLigation reaction mix*1を調製する。
    *1 Ligation reaction mix:5× Ligation solutionを蒸留水で5倍希釈する。希釈後の1× Ligation solutionでLigaseを400倍希釈する(Ligaseは試料へ滴下する直前に調製)。
    ・Wash bufferを除去したスライドにLigation reaction mixを滴下した後、湿潤箱に入れ、30°Cで45分間インキュベートする。
  5. 増幅反応
    ・スライドからLigation reaction mixを除去し、Wash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからWash bufferを除去する。
    ・洗浄中にAmplification reaction mix*2を調製する。
    *2 Amplification reaction mix:5× Amplification solutionを蒸留水で5倍希釈する。希釈後の1× Amplification solutionでPolymeraseを200倍希釈する(Polymeraseは試料へ滴下する直前に調製し、穏やかなピペッティングで十分に混合)。
    ・Wash bufferを除去したスライドにAmplification reaction mixを滴下した後、湿潤箱に入れ、30°Cで100分間インキュベートする。
  6. プローブのハイブリダイゼーション
    ・スライドからAmplification reaction mixを除去し、Wash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからWash bufferを除去する。
    ・洗浄中にDetection probe reaction mix*3を調製する。
    *3 Detection probe reaction mix:10× Probe solutionを蒸留水で10倍希釈する。希釈後の1× Probe solutionでDetection probe (Cy3) を40倍希釈する(穏やかなピペッティングで十分に混合)。
    ・Wash bufferを除去したスライドにDetection probe reaction mixを滴下した後、湿潤箱に入れ、室温の暗所で30分間インキュベートする。
  7. 封入およびイメージング
    ・スライドからDetection probe reaction mixを除去し、Wash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからWash bufferを除去する。
    ・水溶性封入剤を用いて、カバーガラスでスライドを封入する(カバーガラスで覆う際は気泡が入らないように注意し、カバーガラスの周囲をマニキュアでシーリングし、イメージングの前に乾燥させる)。
    ・十分な空間分解能を得るために、40倍以上の対物レンズを用いることを推奨する。
    ・シーリングされたスライドは4°Cの暗所で最大5日間、または-20°Cで最大6か月間保存できる。

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使用例

キット使用例
本製品(#GTX537371-23)を用いて、トランスフェクションしたHEK293T細胞ペレットのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)ブロック(#GTX435640)切片のSARS-CoV-2膜タンパク質の検出を行った。PLAシグナルはCy3(黄色)、核はDAPI(青色)で検出。
A. ポジティブなPLA反応
B. ネガティブコントロール(Mockトランスフェクション)
C. 非特異的なPLA抗体プローブを用いたネガティブコントロール


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キット内容

  • Blocking solution
  • Antibody (Ab) - Oligo A, B
  • Ligase
  • Ligation solution
  • Polymerase
  • Amplification solution
  • Detection probe (Cy3)
  • Probe solution
  • Wash buffer
測定には蛍光顕微鏡が必要です。

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SARS-CoV-2 Membrane Protein Proximity Ligation Assay (PLA) Kit (Cy3) (5tests)
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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