近接ライゲーション法（PLA）を用いた新型コロナウイルスの膜タンパク質検出キット SARS-CoV-2 Membrane Protein Proximity Ligation Assay（PLA）Kit（Cy3）

ウイルス感染した組織またはウイルス感染／トランスフェクションした細胞（セルブロック）から新型コロナウイルスの膜タンパク質を検出するキットです。ウイルス膜タンパク質はPLA（Proximity Ligation Assay）プローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドが結合した一次抗体ペアを用いて検出します。この一組のPLAプローブが膜タンパク質に近接して結合した時のみ生じる増幅シグナルを利用して、特異的かつ高感度に検出します。

※ 「新型コロナウイルス ヌクレオカプシドタンパク質の測定キット」についてはこちらをご覧下さい。
※ GeneTex社の「新型コロナウイルスSARS-CoV-2 （COVID-19）研究に有用な各種製品」についてはこちらをご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

本キットを使用する際は、必ず製品プロトコルをご確認下さい。

1. 反応に用いる領域の画定
   ・スライドガラス用疎水性ペンやシリコンワックスを用いて、スライド上の試料（切片）を取り囲む。
2. ブロッキング
   ・Blocking solutionで試料（切片）を覆うように十分量滴下し、スライドを湿潤箱に入れ、室温で30分間インキュベートする。
3. PLAプローブのインキュベーション
   ・Antibody (Ab)-Oligo A,B（PLA抗体溶液）をBlocking solutionで100倍希釈し、Blocking solutionを除去したスライドに滴下した後、湿潤箱に入れ、4°Cで一晩インキュベートする。
   
4. ライゲーション
   ・スライドからPLA抗体溶液を除去し、Ｗash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからＷash bufferを除去する。
   ・洗浄中にLigation reaction mix^＊1を調製する。
   ＊1 Ligation reaction mix：5× Ligation solutionを蒸留水で5倍希釈する。希釈後の1× Ligation solutionでLigaseを400倍希釈する（Ligaseは試料へ滴下する直前に調製）。
   ・Wash bufferを除去したスライドにLigation reaction mixを滴下した後、湿潤箱に入れ、30°Cで45分間インキュベートする。
   
5. 増幅反応
   ・スライドからLigation reaction mixを除去し、Ｗash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからＷash bufferを除去する。
   ・洗浄中にAmplification reaction mix^＊2を調製する。
   ＊2 Amplification reaction mix：5× Amplification solutionを蒸留水で5倍希釈する。希釈後の1× Amplification solutionでPolymeraseを200倍希釈する（Polymeraseは試料へ滴下する直前に調製し、穏やかなピペッティングで十分に混合）。
   ・Ｗash bufferを除去したスライドにAmplification reaction mixを滴下した後、湿潤箱に入れ、30°Cで100分間インキュベートする。
   
6. プローブのハイブリダイゼーション
   ・スライドからAmplification reaction mixを除去し、Wash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからWash bufferを除去する。
   ・洗浄中にDetection probe reaction mix^＊3を調製する。
   ＊3 Detection probe reaction mix：10× Probe solutionを蒸留水で10倍希釈する。希釈後の1× Probe solutionでDetection probe (Cy3) を40倍希釈する（穏やかなピペッティングで十分に混合）。
   ・Wash bufferを除去したスライドにDetection probe reaction mixを滴下した後、湿潤箱に入れ、室温の暗所で30分間インキュベートする。
   
7. 封入およびイメージング
   ・スライドからDetection probe reaction mixを除去し、Wash bufferで5分間ずつ3回洗浄した後、スライドからWash bufferを除去する。
   ・水溶性封入剤を用いて、カバーガラスでスライドを封入する（カバーガラスで覆う際は気泡が入らないように注意し、カバーガラスの周囲をマニキュアでシーリングし、イメージングの前に乾燥させる）。
   ・十分な空間分解能を得るために、40倍以上の対物レンズを用いることを推奨する。
   ・シーリングされたスライドは4°Cの暗所で最大5日間、または－20°Cで最大6か月間保存できる。
   

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