アデノ随伴ウイルスベクター関連製品 AAV tools（BPS Bioscience社）

A-1. AAVの血清型（セロタイプ）の詳細は☞ AAVの血清型（セロタイプ）について、各AAV血清型の特定の細胞型および組織に対して優先的な結合については☞ AAVの血清型と組織指向性をご覧下さい。

組織指向性と形質導入効率のさらなる向上のために、遺伝子操作されたAAV血清型が開発されました。例えば、AAV-DJは、DNAシャッフリングを使用して8つの異なる野生型AAV血清型（AAV2、4、5、8、9、トリ、ウシ、およびヤギAAV）から作成された合成血清型です。AAV-DJ血清型は広範囲の細胞種に感染することができ、野生型血清型と比較してin vitroおよびin vivoでの形質導入効率が優れています。血清型1～9のin vitro形質導入効率の調査が発表されました（☞ Ellis B.L., et al., 2013）

A-2. AAVにはBiosafety Level 1の施設の使用が必要です。ご使用にあたっては、国や地域、および機関のすべての規制に従い、適切な安全対策を講じて下さい。AAVは複製欠陥があり、病原性がなく、ヒトの病気とは関連していません。野生型AAVは、低い頻度で宿主ゲノムに組み込まれ、主にヒト19番染色体上の「セーフハーバー」部位AAVS1で組み込みが行われます。しかし、組換えAAVベクターは、細胞内にエピソームとして存在するためにゲノムを破壊しません。

A-3. BPS Bioscience社のAAVは、力価≥1 × 10¹²ベクターゲノム（vg）/mlのAAV 2 vial（2×50 μl）として供給されます。したがって、各バイアルには約500億のベクターゲノムが含まれています。力価は、qPCR によって決定され、ロットごとに異なります。正確な値は製品に添付されるデータシートをご参照下さい。

A-4. 各AAV調製物は、イオジキサノール密度勾超配遠心分離法によって精製します。力価はSYBR Green qPCRによって決定します。力価はロットごとに異なるため、正確な値は製品に添付されるデータシートをご参照下さい。

AAV粒子の純度は、One-Step Lumitein UV Protein Gel Stain（Biotium社 #21005）を使用して4～20%SDS-PAGEゲル染色によってロットごとに決定され、≥90%であることが保証されています。AAVに蛍光レポーター遺伝子が含まれている場合は、HEK293細胞に形質導入し、蛍光顕微鏡を使用して機能を確認しています。ルシフェラーゼレポーターAAVの場合は、HEK293細胞に形質導入し、☞ ONE-Step Luciferase Assay System（#60690）を使用してルシフェラーゼ活性を測定しています。SaCas9 AAVの場合は、HEK293細胞に形質導入し、抗HAタグ抗体を使用したウェスタンブロットによってHAタグ融合SaCas9の発現を確認します。

A-5. AAVは使用するまで−80℃で冷凍保存して下さい。AAV粒子は氷上で解凍してから、チューブを素早く遠心分離し、内容物をすべて回収します（ボルテックスで穏やかに混合することも可能です）。AAV粒子は、必要に応じて細胞培養培地で希釈することや、細胞に直接添加することもでき、in vivoで使用するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈することもできます。

※ AAVは凍結／解凍サイクルの影響を受けやすく、ウイルス力価は凍結／解凍サイクルごとに急激に低下する点にご注意下さい。

A-6. ほとんどの接着細胞は、約70%コンフルエントに達すると、効率的に形質導入されます。ただし、例えば、MOIを上げることによって実験条件がそれに応じて最適化されている場合では、AAVは70%コンフルエンシーを超える細胞でも使用できます。

A-7. はい、使用できます。実際に、AAVの形質導入は、人工多能性幹（iPS）細胞や、iPS由来細胞などの初代培養細胞や非分裂細胞を使用する場合において、他のトランスフェクションやウイルス形質導入よりもうまく機能します。

A-8. いいえ。AAVはゲノムに組み込まれないため、安定細胞株を作製には適していません。導入された遺伝子は細胞内でエピソームとして維持され、非分裂細胞では最長で6か月以上、分裂細胞では最長で3か月間発現することができます（使用する細胞の種類とMOIによって異なります）。ただし、分裂中の細胞では時間経過とともに発現量が低下します。

A-9. T2Aリンカーは、同時に2つのレポータータンパク質を発現させるために使用されるThorea asignaウイルス 2Aに由来する自己切断ペプチドです。例えば、AAV Luciferase-eGFPなどのデュアルレポーターAAVシステムは、単一プロモーターの制御下でDNAコンストラクトである「Luciferase-T2A-eGFP」を使用します。この DNAコンストラクトの産物は、タンパク質「ルシフェラーゼ-T2A-GFP」をコードする独特の転写物です。リンカーT2Aは、自己切断を受け、ルシフェラーゼとeGFPが2つの個別のタンパク質としてほぼ同じ割合で放出されます。

A-10. AAVは動物を用いた研究で使用でき、実験動物に注射することができます。BPS Bioscience社の精製プロセスは、AAV調製物から空のカプシドを除去し、高品質のAAV粒子を保証します。必要に応じて、カスタムオーダーとしてさらなる精製または試験をご依頼いただけます。繰り返しますが、BPS Bioscience社の製品は、人体への使用、または診断や治療用途を目的としたものではないことにご注意下さい。

A-11. レポーターAAVを使用すると、目的細胞株における形質導入効率を最適化できます。粒子対細胞の比率は、標的細胞におけるタンパク質発現を最適化する際に変化させる最も重要なパラメーターです。インキュベーション時間の調整は、最適化する次善のパラメータです。温度または細胞密度（接着細胞が形質導入されている場合）を調整すると、形質導入効率が向上する場合もあります。接着細胞の場合、約70%のコンフルエンシーを推奨します。

A-12. SaCas9（Staphylococcus aureus CRISPR-associated protein 9）は、哺乳類細胞においてヌクレアーゼ効率が高いことが実証されており、そのサイズが小さいためAAVのパッケージングに最適です。SaCas9は、SpCas9（Streptococcus pyogenes CRISPR-associated protein 9）よりも長いPAM（protospacer adjacent motif）部位である5'-NNGRRT-3'を認識します。これらのAAV粒子は、CMVプロモーターの制御下でSaCas9を構成的に発現します。これらは、標的細胞内でSaCas9を構成的に発現させ、CRISPR/Cas9技術を使用して細胞を遺伝子操作するために使用されます。

A-13. プロセスの迅速化のために、次の点をご考慮下さい。