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血清、血漿、組織ライセート、尿、細胞培養上清中の総ピロリン酸(Pyrophosphate)を定量できます。 ピロリン酸アッセイキット

掲載日情報:2023/03/24 現在Webページ番号:70488

試料内に含まれる総ピロリン酸を測定するキットです。ピロリン酸を、キットに含まれている各種の酵素を組み合わせて過酸化水素(H2O2)などに変換し、得られた過酸化水素を特異性の高い蛍光プローブで検出します。測定は96ウェルプレートで行い、蛍光プレートリーダーで測定します。

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ピロリン酸とは

ピロリン酸(Pyrophosphate)は二リン酸(Diphosphate)とも呼ばれ、分子内にP-O-P結合を含むリンオキシアニオン(oxyanion)です。ピロリン酸は、アデノシン三リン酸 (ATP) などのヌクレオチド三リン酸を初めとする重要な生化学分子に含まれています。例えば、ピロリン酸はATPがアデノシン一リン酸に加水分解されるときに形成されます。この例として具体的には、ATPなどのヌクレオチド三リン酸(NTP)、あるいはデオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)が、RNAポリメラーゼやDNAポリメラーゼによってRNA鎖やDNA鎖に組み込まれるときのピロリン酸生成が挙げられます。ピロリン酸は、カルシウムなどの遷移金属と容易に複合体を形成し、尿、滑液、および血漿中に十分に高いレベルで存在し、カルシウム塩の蓄積をブロックします。Ankylosis(ANK)遺伝子産物などの膜貫通型ピロリン酸トランスポーターは、細胞内ピロリン酸を細胞外滑液に移動させる可能性があります。また、ピロリン酸カルシウムが過剰に形成されると、結晶化して関節に沈着し、ヒトにおいては関節炎を引き起こす可能性があります。


  • ピロリン酸の分子モデル

    ピロリン酸の分子モデル:分子内にP-O-P結合を有する。

  • ATPの分子モデル

    ATPの分子モデル:RNAポリメラーゼによってRNA鎖に取り込まれる際に、左側のピロリン酸が外れる。

参考文献

  • Ho, A.M. et al., Science, 289(5477), 265~270 (2000). [PMID: 10894769]
  • Votyakova, T.V. and Reynolds, I.J., J. Neurochem., 79, 266~277 (2001). [PMID: 11677254]
  • Rutsch, F. et al., Am. J. Pathol., 158(2), 543~554 (2001). [PMID: 11159191]
  • Ryan, L.M. et al., Arthritis Rheum., 22(8), 886~891 (1979). [PMID: 223577]
  • Rosenthal, A.K. and Ryan, L.M., N. Engl. J. Med., 374(26), 2575~2584 (2016). [PMID: 27355536]

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特長

  • 96ウェルプレートフォーマットで測定を行います。
  • 測定試料:血清、血漿、組織ライセート、尿、細胞培養上清
  • 励起波長:530~570 nm、測定波長:590~600 nm
  • 検出限界:4 μM(ピロリン酸)
  • キットにはピロリン酸標準液が含まれています。

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測定原理


ピロリン酸アッセイキットの測定原理

ピロリン酸をホスホエノールピルビン酸と共存させ、PPDK(ピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ)によりピルビン酸 + アデノシン三リン酸(ATP)およびリン酸に変換する。ピルビン酸は、リン酸(Pi)と酸素の存在下でピルビン酸オキシダーゼによってアセチルリン酸、二酸化炭素、過酸化水素に変換される。得られた過酸化水素を、特異性の高い蛍光プローブで検出する。⻄洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)は、1:1の比率で結合するプローブと過酸化水素間の反応を触媒する働きがある。試料とキット付属の既知濃度のピロリン酸スタンダードを30分間インキュベートした後、標準的な96ウェル蛍光プレートリーダーで読み取り、ピロリン酸スタンダードの検量線を用いて、試料中のピロリン酸濃度を測定する。

それぞれの試料に対して、内因性バックグラウンドを測定するために、PPDKで処理したウェル(+PPDK)と酵素を含まないウェル(-PPDK)の2つのペアのウェルが必要となります。Net RFU(Relative Fluorescence Unit)の値は、PPDKで処理して得られたRFUと、酵素を含まないRFUの差から計算されます。


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使用例


左図:ピロリン酸アッセイキットの検量線の例

ピロリン酸アッセイキットを用いて鶏肉中の量を測定。

右図:ピロリン酸アッセイキットを使用してニワトリ肝臓中のピロリン酸を測定した。ニワトリ肝臓を、マニュアルの試料調製法に従いホモジナイズし、除タンパク質処理を行った。

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キット内容

  • Pyrophosphate standard
  • AMP(Adenosine Monophosphate)
  • PEP(Phosphoenolpyruvate)
  • Na2HPO4
  • Fluorometric probe
  • HRP
  • FAD(Flavin Adenine Dinucleotide)
  • TPP(Thiamine Pyrophosphate)
  • Pyruvate oxidase
  • PPDK(Phosphate Pyruvate Dikinase)
  • Assay buffer
96ウェル黒色マイクロプレートおよび蛍光プレートリーダーが別途必要です。



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価格

[在庫・価格 :2024年07月15日 10時55分現在]

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Pyrophosphate Assay Kit (100 assays)
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保存条件 室温,-20℃,-80℃,暗所保存 法規備考
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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