1つのFFPE組織試料からRNA/DNAを抽出できるキット Mag-Bind FFPE DNA / RNA 96 Kit

磁気ビーズを用いて、1つのキットでホルマリン固定パラフィン包埋（Formalin Fixed Paraffin Embedded, FFPE）組織試料からDNAまたはRNAをそれぞれ抽出します。汎用型の自動分注装置による自動化にも利用できます。有害なキシレンは使用しません。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

標準的なホルマリン固定、パラフィン包埋の手順では、核酸の著しい断片化が起こります。DNA / RNAの断片化の程度を抑えるために、以下のガイドラインを推奨します。

3種類のがん組織（乳がん、肺がん、大腸がん）の1 x 10 μm切片について、3種類のキット（Omega Bio-tek社、A社、B社）にてそれぞれの推奨プロトコルに従い核酸抽出操作を行い、平均収率（n=3）を求めた。定量化には NanoDrop 2000cシステム（Thermo Fisher Scientific社）、QuantiFluor dsDNA and RNAシステム（Promega社）を使用した。いずれの場合も、Omega Bio-tek社キットの収率は、A社やB社キットの収率よりも勝っていた。

各社のキットを用いて単離したDNA（図A）およびRNA（図B）の純度を、分光光度法にて検討した。
A₂₆₀ / A₂₈₀の比は実線の棒グラフで、A₂₆₀ / A₂₃₀の比は斜線の棒グラフで示した。Omega Bio-tek社キットによるDNAおよびRNAのA₂₆₀ / A₂₈₀の平均値は、それぞれ純粋なDNAおよびRNAを示す理論値である1.8および2.0に近い値であり、抽出プロトコルによりDNAとRNAが別々の溶出液に効率よく分離されたことを示した。一方、A社およびB社の場合、抽出したDNAのA₂₆₀ / A₂₈₀の比が2.0に近かったことから、DNA溶出液にRNAが混入している可能性が示された。A₂₆₀ / A₂₃₀比により二次的な純度の測定を行ったところ、精製されたDNAおよびRNAの値は、Omega Bio-tek社が1.33～1.72、A社が0.64以下であった。B社については、A₂₆₀ / A₂₃₀比は、DNAでは2.0以上、RNAでは0.60未満であり、Omega Bio-tek社のキットで抽出された核酸が、他の2社のキットで抽出された核酸よりも高品質であることが示された。

3社のキットのプロトコルに従って得られたDNAおよびRNAの品質と下流の実験への適用に関し、qPCRから得られたThreshold Cycle（C_t）値を比較することによって評価した。10倍希釈したDNA（A）およびRNA（B）の溶出液を用い、ヒト由来DNAおよびRNAに特異的なプライマーを用いたリアルタイムPCRを各メーカーの推奨プロトコルに従い3回行い、得られた平均C_t値を示した。それぞれのFFPE試料からA社およびB社キットで抽出されたDNAやRNAと比べて、Omega Bio-tek社のキットで得られた核酸は、より少ないサイクル数で増幅され、優れた増幅能力と感度の高さを示した。例えば、乳がん組織試料からOmega Bio-tek社キットで精製されたDNAは、A社キットの場合よりも～1.34サイクル、B社キットの場合より～2.35少ないサイクルで増幅され、高収量であることが示された。

それぞれの試料から各社キットで抽出したRNAについてTapeStation 2200（Agilent社）で解析し、3種のがん由来FFPE試料から抽出したRNAのDV₂₀₀値（200 nt以上のフラグメントの割合）を評価した。いずれの抽出方法でも、DV₂₀₀値は20%以上であり、Illumina社のNGS解析で必要とされるFFPE試料からのRNAの品質を満たしていた。しかし、Omega Bio-tek社製品で抽出したRNAは、A社およびB社のキットで抽出したRNAに比べて、200ヌクレオチド以上の断片の割合が有意に高く、高品質なRNAであることが判明した。

大腸がん患部から摘出した組織を、そのまま新鮮凍結保存した試料とFFPE試料で、Omega Bio-tek社、およびA社、B社のキットを用いて精製したDNAについて、ΔCq値を求めた。Omega Bio-tek社製品の場合、ΔCq値はA社およびB社のキットを用いて得られたものよりも低値であった。このことは、得られた核酸の品質が高く、FFPE処理される前の実際の組織試料をより忠実に再現していることを示している。TruSight Tumor 170（Illumina社）ライブラリの最適なパフォーマンスのためには、ΔCq ＜5が推奨されており、Omega Bio-tek社とA社製品で抽出したDNAはこの要件を満たしているのに対し、B社製品で精製したDNAはこの基準を満たしていなかったことを示した。

異なるキットで抽出したDNAについて、シークエンス指標（インサートサイズの中央値（bp）、Exon basesの割合（250xカバレッジ）、Aligned readsの割合）を追跡した。インサートサイズの中央値は、TruSight 170パネル（Illumina社）用に定められた品質閾値79 bpを満たしていた。Omega Bio-tek社キットの性能は、A社のものと同等であり、B社製品と比べると、ほとんどの指標で優れていると思われた。大腸がん試料の場合では、Omega Bio-tek社製品によるFFPE試料由来DNAの品質指標は、新鮮な凍結試料に近いものであった。例えば、インサートサイズの中央値は、凍結試料では176、Omega Bio-tek社製品では160であったのに対し、A社とB社ではそれぞれ157、156と低めであった。また、Exon bases（%）とAligned reads（%）に関しても同様であった。これは、Omega Bio-tek社製品を用いたFFPE試料からのDNA抽出法がより高品質であることを示しており、よって新鮮凍結試料から抽出したDNAの値をより正確に反映していると考えられる。

Omega Bio-tek社およびA社、B社のキットを使用して大腸がん組織FFPE試料から抽出したDNAについて、TP53遺伝子とPIK3R1遺伝子の2つの報告された変異を解析した小規模な変異検出（バリアントコーリング）分析で、新鮮な凍結組織（対照）と比較した。いずれのキットでも、同じ変異が検出されたことを示している。しかし、ここで報告された変異について、新鮮な凍結組織由来試料とFFPE試料の対立遺伝子頻度とカバー率を比較すると、Omega Bio-tek社の抽出物が対照試料由来抽出物と最も一致していた。乳がんおよび肺がんのFFPE組織試料をシークエンスした場合も、同様の結果が得られた（結果は省略）。

※ 抽出精製には、ミネラルオイル、シーリングフィルム（Omega Bio-tek社 #AC1200）などが別途必要です。