オルガノイドの培養方法（解凍・継代・維持・凍結保存など）をご紹介します ATCC^® Organoid Culture Guide

正常／疾患患者由来組織に適用できる、オルガノイドのルーチン処理に関する標準的な操作をご紹介します。基本的な操作方法は、従来の二次元培養や初代細胞の培養を経験した研究者には馴染み深いものです。しかし、オルガノイドの培養は下記に示すように通常の細胞培養よりも考慮すべき点が多く、細かな条件検討と培養試薬・器具の準備が必要です。

本記事では、下記のように基本プロトコル1～3に従ってオルガノイドの培養方法をご紹介します。

• 基本プロトコル1：凍結保存されたオルガノイドの解凍と培養
• 基本プロトコル2：オルガノイドの維持と拡大
• 基本プロトコル3：オルガノイドを凍結保存

• 培養を始める前に
• 基本プロトコル1：凍結保存したオルガノイドの解凍
• 基本プロトコル2：オルガノイドの培養と増殖
• 基本プロトコル3：オルガノイドの凍結保存
• 温水ボトル（フラスコ）の準備方法
• オルガノイド培養の背景および歴史
• オルガノイド培養における重要なポイント
• トラブルシューティング
• 予想されるオルガノイドの状態・形態
• オルガノイド培養に必要な作業時間
• その他関連ウェブページ
• 引用文献

培養を始める前に

• プロトコル全体を確認して下さい。すべてのプロトコルは、無菌培養条件下で無菌の器具、細胞培養グレードの試薬を使用し、適切な防護具を着用して操作する必要があります。実験室での作業中は、常に品質保証管理システム（Good Laboratory Practices； GLP）に従って下さい。
• 安全に関する重要な情報については、使用前にすべての試薬の安全データシート（SDS）を参照して下さい。
• オルガノイドの凍結バイアルに添付される試験成績書またはそのほかの書類を参照して、試料が汚染されていないことを確認して下さい。すべてのヒト由来試料は、潜在的にバイオハザードの可能性があるものとして扱い、適切なバイオセーフティ条件下で取り扱って下さい。詳細は、所属機関の安全管理室へ確認して下さい。

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基本プロトコル1：凍結保存したオルガノイドの解凍

必要な試薬類

解凍前の準備

1. オルガノイドモデル用の培地を準備します。モデル固有の情報を参照し、適切な培地を準備して下さい。同じオルガノイド組織／タイプでも培地組成が異なる場合があり、モデルの表現型が変化する可能性があります。モデル固有の情報が得られない場合は、表1の培地組成例をご覧下さい。
2. 15 mlコニカルチューブへ基礎培地10 mlを移し、室温に戻します。
3. オルガノイドを播種するウェルごとに、2 mlの完全培地を添加して室温に戻します。1×10⁶ cellsの場合、6ウェルプレートの2つのウェルに播種できる量となります。可能であれば、オルガノイドモデル固有の推奨される播種条件の情報を参照して下さい。細胞数が分からない場合は、4 mlの完全培地を室温に戻し、6ウェルプレートの2つのウェルに播種して下さい。
4. ECMを解凍します。ストック容器や分注済みのECMは、4℃で解凍して下さい。冷蔵庫内の温度変化の影響を減らすため、バイアルは氷上か冷却ラックに置いて下さい。5 ml以上のECMを使用する場合は、一晩かけて解凍する必要があります。少量（1 ml以下）の場合、氷上で数時間かけて解凍します。推奨のECMは、オルガノイドモデル固有の情報を参照し、提供された準備と取り扱いの指示に従って下さい。オルガノイドモデルによっては、ECMを所定の最終濃度へ希釈する必要があります。ECMを希釈する場合は、特に指定がない限り完全培地を使用して下さい。オルガノイドモデル固有の情報がない場合、本プロトコルではCell Basement Membrane（ATCC^® ACS-3035^TM）を終濃度10～18 mg/mlで使用します。必要量のみを解凍し、解凍後は氷上に静置して下さい。一度解凍したECMは再凍結しないで下さい。解凍したECMは、4℃で最長7日間保存できます。ECMを希釈した場合は、保管せずにすぐに使用して下さい。
5. 播種する培養容器を、37℃インキュベーターで60分以上温めます（大型の培養容器はさらに時間がかかる場合があります）。



表1：がんオルガノイド用培地の組成例（終濃度）

コンポーネント	基礎的な組成	食道がん	結腸がん	膵臓がん	乳がん
Advanced DMEM:F12	NA	NA	NA	NA	NA
HEPES	1×	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
L-Glutamine	1×	1×	1×	1×	1×
Noggin	Not included	100 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml	100 ng/ml
FGF-10	Not included	100 ng/ml	Not included	100 ng/ml	20 ng/ml
FGF-7	Not included	Not included	Not included	Not included	5 ng/ml
Nicotinamide	Not included	10 mM	10 mM	10 mM	10 mM
N-Acetyl cysteine	Not included	1 mM	1 mM	1.25 mM	1.25 mM
B-27 supplement	Not included	1×	1×	1×	1×
EGF	Not included	50 ng/ml	50 ng/ml	50 ng/ml	5 ng/ml
Heregulin-beta	Not included	Not included	Not included	Not included	5 nM
SB202190	Not included	10 μM	10 μM	Not included	1.2 μM
A83-01	Not included	500 nM	500 nM	500 nM	500 nM
Gastrin	Not included	Not included	Not included	10 nM	Not included
Y-27632	Not included	Not included	Not included	Not included	5 μM
Wnt-3A CM＊1	Not included	0.5	Not included	0.5	Not included
R-spondin1 CM＊1	Not included	0.2	0.2	0.1	0.1

＊1 CM（Conditioned medium；コンディション培地）の詳細はこちらをご覧下さい。
※ 既に確立されたオルガノイドモデル（市販の供給元から提供されたものなど）を培養する場合、抗生物質は含めないで下さい。存在しうる低レベルのコンタミネーションの問題を覆い隠してしまう恐れがあります。細胞がマイコプラズマに汚染されていないかを定期的に検査し、すべての試薬と培地が無菌状態であることを確認して下さい。
※ 基礎培地は完全培地ではありません。オルガノイドの洗浄や簡易的な保管に使用して下さい。
※ ATCC^®の各種オルガノイドの培養に最適化されたOrganoid Growth Kitはこちらをご覧下さい。




解凍

6. オルガノイドの凍結保存バイアルを液体窒素貯蔵庫から取り出し、37℃のウォーターバスで直ちに解凍します。キャップを持って、ウォーターバス内でバイアルを静かに旋回させます（バイアルを完全に浸さない）。少量の氷が残る程度まで解凍します。オルガノイドの生存率と回復率を損なわないよう、1～2分程度で解凍して下さい。
7. バイアルを70%エタノールで除菌し、キャビネットに移します。
8. P1000ピペッターで、クライオバイアル内の溶液を手順2で調製した10 ml基礎培地入りコニカルチューブに滴下します。
9. バイアル内に残っている細胞を回収するため、クライオバイアルに1 mlの基礎培地を添加してピペッティングし、前述のバイアルに添加します。
10. 懸濁液を遠心分離してペレットにします。モデル固有の情報を参照し、推奨される速度と時間で遠心分離して下さい。オルガノイドモデル固有の情報がない場合、室温で500×gで5分間遠心分離します。
11. ペレットを崩さないよう丁寧に上清を吸引除去し、チューブを室温に保ちます。遠心分離後、ぼんやりとした液状のECM層が存在する場合があります。倒立顕微鏡で観察して、ECM層にオルガノイドがあまり含まれていない場合は、ECM層を吸引して廃棄します。オルガノイドがECM層に残っている場合は、さらに洗浄を行えます。10 mlの冷やした基礎培地を加え、手順10と11を繰り返します。
12. 冷やした液体ECMでペレットを再懸濁します。P200ピペッターを使用して、20～30回（ペレットが完全に再懸濁されるまで）ピペッティングします。バイアルあたりの細胞数やその他の播種手順についてはロットごとの情報を参照して下さい。通常、解凍後のオルガノイドは、6ウェルプレートに1ウェルあたり100 μlのECM、細胞密度2.5～5×10⁵ cellsで播種します。細胞数が分からない場合は、200 μlのECMでペレットを再懸濁し、6ウェルプレートの2つのウェルに100μlずつ播種します。ピペッティング中、ECMに気泡が入らないようにして下さい。早期のECM重合を防ぐために、チューブと内容物を温めないように、すばやく作業します。すぐ播種できない場合は、ECMとオルガノイドの懸濁液を含むチューブは、氷上に静置します。
13. 温めておいた培養容器をインキュベーターから取り出し、キャビネットに入れます。以降は、容器が温かいうちに迅速に作業して下さい。より大きな容器に播種したり、重合しにくいECMを使用する場合は、キャビネット内に温水ボトルを用意して（温水ボトルの準備方法参照）、その上に容器を置いて温度を維持します。
14. P200ピペッターでオルガノイド懸濁液100 μlを吸引し、温めた6ウェルプレートへ10～15 μlずつ液滴として分注します。播種する各ウェルに対して繰り返します。播種の直前に、ピペッティングを繰り返して、均一な懸濁液を維持して下さい。大量の液滴を分注する場合は、気泡が入らないよう注意しながら、定期的にピペッティングする必要があります。素早く、１ウェルあたり8～10つの液滴を分配していきます。液滴が互いに接触したり、ウェルの壁面に触れないようにして下さい。液滴は隆起したドームを形成します。
15. 播種後、すぐにプレートに蓋をして慎重に裏返します。裏返すとドームが簡単に形成され、オルガノイドがECM中に沈み、プラスチック表面との接触を最小限に抑えることができます。
16. 裏返したプレートを37℃のインキュベーターに移します。プレートを15～30分間そのままにして、ECMを重合させます。
17. プレートをキャビネットに戻し、通常の向きに戻します。ドームが形成されない場合は、トラブルシューティングを参照して下さい。
18. ドームを壊さないように、室温で温めた完全培地を播種したウェルに2 mlずつ慎重に添加します。
19. オプション操作：ROCK Inhibitor Y-27632（例: ATCC^® ACS-3030^TM）の10 mMストック溶液2 μl（完全増殖培地1 mlあたり1 μl）を増殖培地に添加します。Y-27632の必要性は、オルガノイドモデル固有の情報を参照して下さい。オルガノイドモデルによっては、ROCK inhibitorを解凍後に添加し、回復率を改善することができます。オルガノイドモデル固有の情報がない場合は、Y-27632を培地に終濃度10 μMとなるよう添加します。
20. プレートをインキュベーターに戻し、3日間培養します。明視野顕微鏡で成長を観察します。オルガノイドは通常、解凍後2～7日で確認できます。
21. 培地交換は、ドームを壊さないようウェルから培地を完全に吸引し、室温に温めた2 mlの完全培地を加えます。必要な場合を除き、完全培地にはY-27632を添加しないで下さい。ドームはプレート表面から剥がれることがありますが（考えられる原因は、トラブルシューティングを参照）、まだ使用できるオルガノイドが含まれている可能性があるため、可能であれば廃棄しないで下さい。培地交換する際は、浮遊しているドームを吸引しないようにして下さい。
22. 2～3日ごとに完全培地で培地交換を行います。

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基本プロトコル2：オルガノイドの培養と増殖

必要な試薬類

準備

1. 完全培地は室温に温め、基礎培地は4℃（氷上）に保ちます。
2. ECMを4℃で解凍し、必要に応じて希釈します（モデル別の情報を参照して下さい）。解凍後は氷上に静置して下さい。
3. 継代に用いる培養容器を37℃のインキュベーターに入れ、少なくとも60分間インキュベーションします。



ECMの除去と洗浄

オルガノイド継代の最初のステップは、ドーム状オルガノイドを機械的に壊して基礎培地で洗浄し、可能な限り多くのECMを除去することです。一部のECMは、洗浄溶液を冷やすと液状に戻りやすく、ECMを簡単に除去できます。1つのチューブ内で処理するドームの数が多いと、ECMの除去が難しく、通常よりも多くの洗浄ステップが必要です。

4. ドームを壊さないよう、培養容器から培地を吸引除去します。吸引の際は、浮遊しているドームを吸わないように避けて下さい。
5. セルリフターで、プレート表面から容器の底または角に付着したドームを掻き取ります。ドームをできるだけ壊さないようにして下さい。ドームを無傷の状態で洗浄用チューブに移すことで、オルガノイドの組織培養プラスチックへの付着を最小限に抑えることができます。セルリフターは小型、使い捨て、滅菌済みなので、ディッシュでの作業に適しています。セルリフターがない場合は、小型のセルスクレーパー（Corning社#3010など）またはP1000ピペットチップの先端を使用して、プレート表面からドームをこすり取ることもできます。
6. 分離したドームを含む各ウェルに少量の基礎培地（例：6ウェルプレートの場合は0.25 ml/well、10 cm² ディッシュの場合は最大1 ml/dish）を加えると、ドームのピペッティングが容易になり、ピペットチップ表面への付着を防げるため、その後の移し替えが容易になります。
7. 冷やした基礎培地であらかじめ湿らせたP1000ピペットチップまたは5 mlのセロロジカルピペットを使用し、回収したドーム塊と培地を空のコニカルチューブに移します。ECM量ごとの推奨チューブサイズは、表2をご覧下さい。
   使用直前にピペットチップやピペットを濡らした後、内部をコーティングするのに十分な基礎培地を分注します。少量の基礎培地と、ピペットチップを基礎培地であらかじめ湿らせておくことで、ドームのピペットチップ表面への付着を抑制します。
   6ウェルプレート1枚では、1度に最大6ウェル分のECM（総ECM量600～1,200 μl）をまとめて回収することが可能です。より大きな培養容器の場合は、ECMの除去を簡単に行うために、まとめず個別に処理します。液量が多いほどECM除去の洗浄ステップも多くなり、収量が減少する可能性があります。



表2：分散バッファーや希釈バッファーの液量

培養器材	ECM量	コニカルチューブサイズ	洗浄液量	分散バッファーの液量	希釈液量
6 well plate (1 well)	100～200 μl	15 ml	≦15 ml	2～3 ml	≦10 ml
6 well plate (2 wells)	200～400 μl	15 ml	≦15 ml	4～6 ml	≦10 ml
6 well plate (3 wells)	300～600 μl	50 ml	≦20 ml	6～9 ml	≦20 ml
6 well plate (4 wells)	400～800 μl	50 ml	≦50 ml	8～10 ml	≦50 ml
6 well plate (5 wells)	500～1,000 μl	50 ml	≦50 ml	10～11 ml	≦50 ml
6 well plate (6 wells)	600～1,200 μl	50 ml	≦50 ml	11～15 ml	≦50 ml
10 cm2ディッシュ	600～1,200 μl	50 ml	≦50 ml	11～15 ml	≦50 ml



8. 冷やした基礎培地であらかじめ湿らせたP1000ピペットチップを使用して、オルガノイド・ECM・培地の混合物を20～30回ピペッティングして、ドームを完全に破壊します。このステップでドームを十分に機械的に破壊し、オルガノイドをECMから遊離させることが重要です。
9. 冷やした基礎培地でチューブを最大量まで満たします。オルガノイドを冷やした基礎培地で洗浄するとECMが液状になり、次のステップで簡単に除去できます。
10. 懸濁液を遠心分離してペレットにします。モデル固有の情報を参照し、推奨される速度と時間で遠心分離して下さい。モデル固有の情報がない場合は、500×gで5分間、できれば4℃で遠心分離します。
11. ペレットを吸引しないよう、慎重に上清を除去します。遠心分離後に、濁ったECMの液層が存在する場合があります。ECMにオルガノイドが含まれていなければ、吸引して廃棄します。オルガノイドがECM液層内に残っている場合は、操作9～11を繰り返しさらに洗浄します。

オルガノイドの分散と洗浄

ECM除去後に、オルガノイドは単一の細胞または細胞塊に分散させます。モデルによっては機械的破壊または酵素的解離のみで十分な場合もあれば、両方の操作が必要になる場合もあります。分散しやすさは、モデルによって大きく異なる場合があります。分散条件についてはモデル別の情報を参照し、推奨の方法に応じて手順12、13、14から始めます。

12. 機械的処理のみの場合：P1000ピペッターで、ペレットを1～2 mlの基礎培地に再懸濁します。チップをチューブの底に押し付けながら20～30回ピペッティングして、オルガノイドをより小さな細胞塊にします。懸濁液がコニカルチューブに入ったままの状態で倒立顕微鏡で観察し、オルガノイドが細胞塊になるまで操作を続けます。その後、操作18に進みます。オルガノイドの機械的処理が困難な場合のヒントについては、トラブルシューティングを参照して下さい。
13. 機械的処理と酵素を併用する場合：P1000ピペッターで、ペレットを1～2 mlの分散用バッファー（室温）に再懸濁します。チップをチューブの底に軽く押し付けながら、20～30回ピペッティングします。懸濁液をコニカルチューブに入れたまま、倒立顕微鏡で分散状態を観察し、オルガノイドが細胞塊になるまで機械的処理を続けます。その後、手順14の酵素処理に進みます。推奨の分散バッファーは、モデル別の情報を参照して下さい。モデル別の情報がない場合は、Trypsin-EDTA for Primary Cells またはTrypLE Expressをお勧めします。
14. 酵素処理のみの場合：表2で推奨されている量の分散バッファー（室温）をオルガノイドペレットに加え、最大速度で短時間ボルテックスして再懸濁します。チューブを37℃のウォーターバスに3～15分間置き、定期的にボルテックスします。大量の分散バッファー（10 ml以上）を使用する場合、37℃に達するまでに10分以上かかる場合があります。オルガノイドを再懸濁する直前に、必要量の分散バッファーを37℃のウォーターバスで5～10分間温めておくと、より迅速に解離させることができます。
15. 2～3分ごとに倒立顕微鏡で破砕状態を観察し、懸濁液中のオルガノイドが目的の状態（単一細胞または小さな細胞塊）になったら処理を停止します。オルガノイドモデルによっては、単一細胞まで分散させるとオルガノイド形成能力が損なわれる場合があります。必要に応じて、モデル別の情報を参照して下さい。モデル別の情報がない場合は、オルガノイドモデルが回復することを実験的に確認できるまでは、単一細胞まで分散させないで下さい。
16. オプション：細胞数を計測する場合は、懸濁液から少量を採取します。完全に分散していない場合は、分散バッファーを添加した状態で37℃でインキュベート（必要に応じて定期的にボルテックス）し、単一細胞に分散させます。継代時には完全に解離させないモデルの場合、6ウェルプレートなら1ウェル分を採取し、単一細胞懸濁液に解離させて細胞数を計測します。ここで計測した細胞数を元に、同時に培養している他のプレート／容器の細胞数を推定します。分散バッファーで長時間インキュベーション（15分以上）することによる効果は、モデルによって異なります。
17. 分散を停止するには、等量以上の基本培地で分散バッファーを希釈し、チューブの最大量まで加えます。推奨量は、表2をご覧下さい。
18. 懸濁液を遠心分離してペレットにします。モデル別の情報を参照し、推奨される速度と時間で遠心分離して下さい。オルガノイドモデルごとの情報がない場合は、500×gで5分間（可能なら4℃で）遠心分離します。
19. ペレットを崩さないように、慎重に上清を吸引して廃棄します。



表3：容器サイズごとの推奨ECM量

培養容器	表面積（cm2）	ECM量＊2	ドームの数
48ウェルプレート (1 well)	0.95	10 μl	1
24ウェルプレート (1 well)	1.9	20 μl	1～2
12ウェルプレート (1 well)	3.8	40 μl	3～4
6ウェルプレート (1 well)	9.5	100 μl	8～10
6ウェルプレート (entire plate)	57	600 μl	48～60
10 cm2 ディッシュ	55	600 μl	48～60

＊2ECMは10 μlの液滴として分注して下さい。




オルガノイドの播種

分散後、単一細胞または細胞塊を新鮮なECMに再懸濁し、3Dドームとして培養容器に戻します。操作スピードと温度は、オルガノイドとECMの取り扱いにおいて重要なパラメーターです。通常、複数の小さな培養容器に播種する方が、大きな容器に播種するよりも操作が簡単です。
すべてのセロロジカルピペットやピペットチップは、オルガノイドの付着を防止するため、基礎培地であらかじめ濡らしておきます。

20. ペレットを少量の基礎培地に再懸濁し、単一のチューブにまとめて（必要に応じて複数のチューブから回収したオルガノイドをまとめることもできます）、操作18と19を繰り返します。
21. 細胞ペレットをECMに再懸濁します。一般的なECM量は、表3をご覧下さい。P1000ピペッターを使用して、20～30回にピペッティングして混合、または完全に再懸濁します。気泡が入らないようご注意下さい。推奨の播種密度は、HCMIモデルごとの情報を参照して下さい。モデルごとの情報がない場合は、1：4の割合で分割（例：6ウェルプレートの1ウェルを継代する場合、ペレットを400 μlのECMに再懸濁し、新しい6ウェルプレートの4つのウェルに100 μlずつ播種）するか、ECM 100 μlあたり5×10⁵ cellsの生細胞の割合で再懸濁します。ECMが早く重合するのを防ぐため、迅速に作業し、ECMを低温に保ちながら時々ピペッティングで混合して均一な懸濁液の状態にします。
22. インキュベーターから培養容器を取り出し、キャビネットに移します。培養容器が温かい状態であればドーム形成が促進されるため、迅速に操作します。必要に応じて、37℃に保温した水を満水に入れた大型容器をキャビネット内に入れ、その上に培養容器を置きます（温水ボトルの準備方法をご覧下さい）。
23. P200ピペッターを使用し、適量のECM／オルガノイド懸濁液を吸引し、10～15 μlの液滴として培養容器表面に均一に滴下します。6ウェルプレートに播種する場合は、100 μlを吸引して1ウェルに播種します。より大きな容器（例：10 cm2 ディッシュ）に播種する場合は、一度に200 μlを吸引して下さい。推奨のECM量と容器サイズについては、表4をご覧下さい。播種の直前にピペッティングで溶液を均一にします。大量のECM／懸濁液を播種する場合、定期的に混合する必要があります。気泡を混入させないようにして下さい。液滴は互いに接触したり、ウェルの壁に触れないようにして下さい。迅速に作業して下さい。液滴は分離したままで、盛り上がったドーム状にしておきます。



表4：容器サイズごとの推奨増殖培地量

培養容器	培地量
48ウェルプレート (1 well)	0.25～0.3 ml
24ウェルプレート (1 well)	0.5～0.75 ml
12ウェルプレート (1 well)	1～1.5 ml
6ウェルプレート (per well)	2～2.5 ml
6ウェルプレート (entire plate)	12～15 ml
10 cm2 ディッシュ	12～15 ml



24. すぐに容器に蓋をして、ドームを壊さないように慎重に裏返しにして下さい。プレートを反転すると、ドームが簡単に形成され、解離したオルガノイドが重合する前にドーム底に沈む可能性が低くなります。
25. 容器は逆さのまま、37℃の細胞培養インキュベーターに移します。ECMを重合させるため、容器を15～30分静置します。
26. 容器をキャビネットに移し、通常の向きに戻します。ドームが形成されない場合は、トラブルシューティングをご覧下さい。
27. ドームを崩さないよう注意して、室温の完全培地を添加します。培養容器ごとの推奨培地量は表4をご覧下さい。継代時にY-27632の添加が推奨されるかどうかは、HCMIモデルに付属の情報をご覧下さい。モデルごとの情報がない場合には、継代時にY-27632は添加しないで下さい。
28. プレートをインキュベーターに戻します。
29. 2～3日ごとに培地交換を行い、必要に応じて継代を行います（モデルによっては7～14日ごと）。

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基本プロトコル3：オルガノイドの凍結保存

必要な試薬類

準備

1. オプション操作：オルガノイドを培養している6ウェルプレートの中から1～3ウェルについて、基本プロトコル2の操作4～11および13～16を行います。これらは、より大きな容器サイズ（例えば、10 cm2 ディッシュ）で並行して成長したオルガノイドの細胞数を推定するために使用されます。複数のウェルから回収する場合、オルガノイドはまとめずに別々に回収し、それぞれ細胞数を計測、平均して、1ウェル分のオルガノイド細胞数とします。例えば、6ウェルプレートの3つのウェル（各100 μl ECM）からの個々の総生細胞数を計測し、1.0×106、1.5×106、0.75×106という結果になった場合、10 cm2ディッシュの推定生細胞（600 μl ECM）は6.5×106です。細胞数が想定よりも著しく少ない場合、基本プロトコル2に従ってオルガノイドを継代および増殖させる必要があります。細胞数が想定よりわずかに少なく、継代は必要でない場合（内腔に顕著な細胞片の蓄積やその他の分化の兆候がない場合）、オルガノイドをさらに1～2日間培養し、再度細胞数を計測して下さい。
2. 凍結保存するオルガノイド1バイアルあたり0.5 mlの凍結保存用培地を解凍し、氷上に置きます。推奨の凍結保存用培地は、各モデルの説明書をご覧下さい。モデル固有の情報がない場合、本プロトコルではStem Cell Freezing Media（ATCC^®）およびRecovery Cell Freezing Medium（Thermo Fisher Scientific社）を使用します。
3. 基礎培地を氷上に置きます。
4. 凍結バイアルにラベルを付け、キャビネットに移します。



凍結保存用培地を用いたオルガノイドの保存

5. 基本プロトコル2の手順4～11に従って、ドームからオルガノイドを回収しECMを除去して下さい。酵素処理のステップは、単一細胞からの回収が可能なモデルのみ行って下さい。必要に応じて、基本プロトコル2の手順17までを参考にして下さい。
6. 複数の容器から回収する場合は、1つのコニカルチューブに集め、モデル推奨の遠心分離条件に従ってペレット化します。モデル固有の情報がない場合は、4℃、500×gで5分間遠心分離して下さい。
7. 2×106 cellsあたり（上記で計算した推定細胞数）、または100～200 μlの採取ドーム（6ウェルプレートの1～2ウェル）あたり0.5 mlの凍結保存用培地でペレットを再懸濁します。
8. 10 mlセロロジカルピペットで、オルガノイドと凍結保存用培地の懸濁液をラベル付き凍結バイアルに0.5 mlずつ移します。ピペッティングして、均一な懸濁液にします。必要に応じて、セロロジカルピペットを凍結保存用培地であらかじめ湿らせて、細胞の付着を防いで下さい。
9. バイアルを凍結保存容器に入れます。オルガノイドを最適な状態で回復させるためには、CoolCell LX（ATCC^® ACS-6000^TM）などの凍結保存容器を使用して、1℃／分の速度で凍結保存する必要があります。
10. バイアルを液体窒素の気相部に移し、長期保存します。

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温水ボトル（フラスコ）の準備方法

1. T225フラスコをキャビネット内に垂直に置きます。
2. キャップを外し、滅菌水（1 L）で完全に満たします。
3. フラスコの蓋を締めます。可能であれば、プラグシールキャップを使用して下さい。
4. パラフィルムをキャップにしっかりと巻き付けます。
5. フラスコを水平に傾けます。気泡が生じないようにして下さい。
6. 37℃のインキュベーターに移します。フラスコは、常時インキュベーターに保管するか、使用する6時間前にインキュベーターに入れます。

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オルガノイド培養の背景および歴史

• 神経細胞、免疫細胞、および間質細胞によって提供される完全な細胞ニッチを再構成することができず、生理学的関連性を制限する。
• 血管新生ができないため、in vitroでオルガノイドの成長の可能性が根本的に制限される。
• 未定義のマウス由来ECMを必要とするため、ロット間の変動が懸念され、ゼノフリー培養が行えない。
• 固化したゲルECMでは、薬物や化合物の浸透性がオルガノイドの到達に影響を与える可能性がある。
• オルガノイドは本質的にHeterogeneousであり、Homogeneousな細胞株よりもin vivo組織として適すが、培養時におけるオルガノイドのサイズと形態の範囲が、表現型スクリーニングを困難にする可能性がある。

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オルガノイド培養における重要なポイント

使用するECMの選択

培地の選択と準備

コンディション培地（馴化培地）

ドーム形成培養のスケールアップ制限

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トラブルシューティング

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予想されるオルガノイドの状態・形態

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オルガノイド培養に必要な作業時間

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その他関連ウェブページ

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引用文献

• Bartfeld, S., et al., Gastroenterology, 148(1):126～136(2015). [PMID：25307862]
• Chio, I. I. C., et al., Cell, 166(4), 963～976(2016). [PMID：27477511]
• Laboratory stock solutions and equipment. Curr. Protoc. in Cell Biol., 1, A.2A.1–A.2A.10. doi: 10.1002/0471143030.cba02as00(2001).
• Dekkers, J. F., et al., Nat. Med., 19(7), 939～945(2013). [PMID：23727931]
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