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組換え単鎖Fv抗体フラグメントの大腸菌での発現用カセットベクター E. coli Expression Vector pOPE101

掲載日情報:2022/05/20 現在Webページ番号:70232

組換え単鎖Fv抗体フラグメント(scFv)を大腸菌でペリプラズム空間へ分泌発現させるベクターです。

pOPE101を用いたscFv抗体フラグメント発現について

組換え抗体の産生において、当初は、完全な免疫グロブリン分子を産生することができないものの、異なる特異性を有する様々な組換え単鎖Fv抗体フラグメント(scFv)を発現させるために大腸菌(E. coli)が広く使用されてきました。この手法では、まず、ScFv抗体フラグメントを細胞質封入体として沈殿させ、次いでin vitroでリフォールディングさせます。しかし、この手法は一般的にフォールディング効率が低いことから、その後に真核細胞を用いた抗体のフォールディング条件をよりよく模倣する方法が開発されました。

抗体フラグメントをE.coliのペリプラズム空間に分泌させることにより、分子内ジスルフィド結合が正しく形成された可溶性で機能を有するタンパク質として産生が可能になります。この方法は、総収量では従来の封入体をリフォールディングさせる方法に比べて低くなりますが、抗原結合活性と特異性の迅速な評価に優れています。カセットベクターpOPE101(Genbank No.Y14585)は、ハイブリドーマ、個々のB細胞クローン、および抗体ライブラリーから単離した重鎖および軽鎖Fv遺伝子フラグメントを、別売りのプライマーセット(#F2000、#F2010)を用いてクローニングするために設計されました1

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ベクターの構造

pOPE101 101-215(Yol)

pOPE101 101-215(Yol)、3970 bp

pOPE101 Expression Vector_insert region

pOPE101 Expression Vector_insert region

V<sub>H</sub> insertion region of pOPE101 V<sub>L</sub> insertion region of pOPE101
  • pelBリーダー配列(ペリプラズム空間への融合タンパク質の分泌)と、検出・精製を容易にするためのタグをコードした領域の間に、重鎖(VH)および軽鎖(VL)ドメインをコードした遺伝子配列をインフレームでクローニングします。
  • 重鎖(VH)および軽鎖(VL)遺伝子の間は、CH1定常領域の最初の6aaと親水性ブタ脳α-チューブリンペプチド配列(EEGEFSEAR)を含む18アミノ酸残基をリンカーとしてコードするDNAフラグメントによって連結されています。
  • VLドメインコード領域の3'末端側には、c-mycタグがあり、Anti-c-Myc1 antibody(9E-10)によってエピトープ(EEKLISEEDL)を認識できます2
  • これに6×His残基が続き、Niキレートレジン(IMAC、Immobilized Metal Chromatography)により、容易に融合タンパク質の精製を行うことができます。
プロモーター P/A1/04/03(IPTG誘導性合成プロモーター)
クローニングサイト 重鎖(VH NcoIおよびHindⅢ
軽鎖(VL MluIおよびNotI
ターミネーター T7
複製起点 ColE1
選択マーカー アンピシリン耐性遺伝子

播種に際しては、100 mMグルコースおよび100μMアンピシリン含有のLB Agarの使用をお勧めします。

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参考文献

  1. Schmiedl, A, et al., "Effects of unpaired cysteines on yield, solubility and activity of different recombinant antibody constructs expressed in E. coli", J. Immunol. Methods., 242(1~2), 101~114 (2000). [PMID:10986393]
  2. Evan, G.I., et al., "Isolation of Monoclonal Antibodies Specific for Human c-myc Proto-Oncogene Product.", Mol. Cell Biol., 5(12), 3610~3616 (1985). [PMID:3915782]
  3. Schmiedl, A. and Dübel, S., "Functional Minipreps. In: Antibody Engineering", ed: R. Kontermann and S. Dübel, Springer Verlag, Heidelberg (2001). (reference
  4. Zhou, H., et al., "Optimization of primer sequences for mouse scFv repertoire display library construction.", Nucleic Acids Research, 22(5), 888~889 (1994). [PMID:8139934]

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E. coli Expression Vector pOPE101

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