最先端のDNAトランスフェクション性能をぜひお試し下さい！ FuGENE^® 4K

FuGENE^® 4Kは哺乳動物細胞へのプラスミドをはじめとした各種DNA導入のためにデザインされた、最新かつ最先端の100%化学合成の脂質およびポリマーベースのトランスフェクション試薬です。トランスフェクションが困難な細胞において多数の実績があるFuGENE^® HDを改良し、さらに高性能化しました。FuGENE^® 4Kは幅広い細胞種に対して穏やかで細胞毒性が低く、かつ高効率なDNA導入を可能にし、ルーティンのトランスフェクションおよび導入が困難なトランスフェクションのいずれにもお使いいただけます。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

各細胞株におけるトランスフェクション効率と細胞生存率の比較
96ウェルプレートに播種したA549、C2C12、HCT116、CHO-K1、HeLa、NIH3T3、LNCaP、PANC1、SKOV3の各細胞株に対して、FuGENE^® 4Kまたは他社製品をGFP発現プラスミドと混合して（混合比3:1, 4:1, 5:1）トランスフェクションした。トランスフェクション48時間後に、トランスフェクション効率と細胞生存率をフローサイトメトリーによって測定した。その結果FuGENE^® 4Kは、他社製品とほぼ同様に細胞毒性が低いにもかかわらず、より高いトランスフェクション効率を示した。

※ 使用方法の詳細はプロトコルをご確認下さい。タイトルまたは画像をクリックするとPDFファイルをダウンロードできます。

背景
がん細胞だけを攻撃する理想的な治療を目指して、これまで主に発がんタンパク質を標的とした治療薬開発が行われ、分子標的治療が確立してきました。一方で、神経・筋疾患に対する新たな治療薬として細胞内の核酸（DNA/RNA）を直接標的にできる核酸医薬への注目が近年高まっています。
　核酸医薬とは、化学合成された 20 塩基長程度の連結したオリゴ核酸で構成され、タンパク質に翻訳されることなく直接生体に作用する医薬品の総称です。アンチセンス、siRNA、アプタマー、CpG オリゴなど様々なものがあり、タンパク質だけでなく標的遺伝子の核酸に直接作用できることが特徴です。主な目的は①標的遺伝子の発現を低下させること、②転写後のpre-mRNA からイントロンを除去してエクソンのみを繋ぐプロセスである「スプライシング」を制御することです。
　がんを引き起こす原因として最も頻度の高い RAS ファミリーKRAS、NRAS、HRAS 遺伝子には、スプライシングに関する致命的な弱点があることを発見しました。この弱点を利用して、核酸医薬でスプライシング異常を誘導することで、早期終止コドンを生じさせてがんを自滅させるという新たな治療法を提唱しました（図1 、文献1）。 本稿では、 別の遺伝子RAD51C を標的とした核酸医薬による細胞実験を例に、トランスフェンクション試薬の選択とスプライシング異常誘導効率の違いについてお示しします。

（図1）核酸医薬でがん細胞だけを攻撃する治療戦略

方法
　まず、RAD51C 遺伝子を標的とした PS＋2‘MOE 核酸医薬を設計しました。RAD51C 変異がん細胞株を 12 ウェルプレートに 10 万個ずつ播種し、24 時間後に PS＋2‘MOE（最終濃度300 nM）を 3 種類のトランスフェクション試薬（他社製品、FuGENE^® HD、FuGENE^® 4K 各最終濃度 0.3％）によって導入しました。
導入 48 時間後に細胞を回収して RNA 抽出および cDNA 合成を行いました。標的である RAD51C および等量の検体であることの確認のための GAPDH に対して設計したプライマーを用いて PCR を行い、その PCR 産物をアガロースゲルで電気泳動しました。

結果
　核酸医薬を投与していないコントロール検体では、RAD51Cの1本の正常なバンドが確認されました。核酸医薬を投与した3 検体では、エクソンスキッピングによる短いバンドが誘導されました。 エクソンスキップが生じたバンドは、 他社製品＜FuGENE^® HD＜FuGENE^® 4Kの順に濃くなっていました。
検体間に GAPDH のバンドの濃度の違いはありませんでした。

（図2）導入試薬の違いとエクソンスキッピング誘導効率

製品を使用したご感想
今回用いた細胞モデルにおいて、従来のトランスフェクション試薬と比べて FuGENE^® 4K によって核酸医薬によるエクソンスキッピングをより効果的に誘導することができました。核酸医薬を使った細胞実験において、トランスフェクション試薬のゴールデンスタンダードとして今後も使用していきたいと思います。

参考文献
Kobayashi, Y＊. et al. Silent mutations reveal therapeutic vulnerability in RAS Q61 cancers.
Nature 603, 335～342,（2022）.
＊co-corresponding

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Fugent社は高い知名度を誇るトランスフェクション試薬ブランド「FuGENE^®シリーズ」を製造・販売するメーカーです。今回は、製品開発・セールス・マーケティング部門ディレクターのTony Larsen氏（写真）にお話を伺いました。
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