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存在量の少ない糖ペプチドをMS解析できるキット Click-&-Go IsoTAG Kit

掲載日情報:2021/11/26 現在Webページ番号:69580

IsoTaG(Isotope Targeted Glycoproteomics)法により,存在量の少ない糖ペプチドをMS解析できるキットです。従来のショットガンプロテオミクス法によるMS解析では,存在量の多いタンパク質のみが検出され,疾患バイオマーカーとなりうる微量の糖ペプチドが検出できないという問題点がありました。
本キットは,あらかじめクリック反応用の官能基を有する糖化合物(キットには含まれていません)を含む培地で細胞を培養して糖タンパク質を標識した後に,薬剤などでの処理細胞・未処理細胞それぞれに質量の異なるIsoTaG Probeをクリック反応により試料に結合させます。これを用いて糖タンパク質を濃縮した後,MS解析を行うことにより,存在量の少ない糖ペプチドの検出も行えます。

IsoTaG法のワークフロー

IsoTaG法のワークフロー
  1. 細胞にアジドまたはアルキン修飾した糖を取り込ませ,糖タンパク質を代謝的に標識する。
  2. 細胞を破砕してライセートにする。
  3. 標識と対になるIsoTaG Probeでクリック反応を行った後,ストレプトアビジン-アガロースビーズ上に固定する。
  4. 必要に応じて,タンパク質を消化する。
  5. リンカーを開裂させてビーズを切り離し,タンデムMS解析に用いる。

タンデムMSで得られた情報の解析に用いるソフトウェアIsoStamp v2についてはこちらからダウンロードして下さい。


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糖タンパク質解析におけるショットガン法の問題点と,IsoTaG法の概要について

ショットガンプロテオミクス法の問題点

ショットガンプロテオミクス法では,タンパク質の混合物試料をプロテアーゼ処理し,生じたペプチドをLCで分離後,MSで検出し,得られたペプチド配列からそれらの親タンパク質を推定します。親タンパク質の推定の際には,MSで得られた各ペプチド断片の配列情報を,試料生物のプロテオームについてのin silicoでのタンパク質分解物情報と比較し,割り当てを行います。
一般的に,最も豊富なペプチドのみが選択され,断片化されるため,存在量が比較的少量のペプチドのデータは取得されません(下図参照)。ショットガンプロテオミクスに特有の問題点は,濃度差が最大12桁に及ぶ可能性のあるタンパク質の測定に用いるため,疾患バイオマーカーなどの存在量の少ないタンパク質の特定が困難なことです。

IsoTaG法の概要

IsoTaG法は,試料細胞中の糖タンパク質の同位体標識と濃縮,タンデムMS(MS2またはMSn)解析,得られた結果からの糖ペプチドの割り当ての各ステップにより行われます。
同位体標識は,アジドまたはアルキンを有する糖化合物を含む培地中で細胞または組織試料を培養することにより,代謝的にこれを取り込ませた後,安定同位体により質量の異なるIsoTaG Probeをクリック反応により,糖タンパク質に結合させます。
培地に添加する修飾糖化合物の例としては,糖タンパク質上で対応したアジドシアル酸(SiaNAz)に変換されるN‐Azidoacetylmannosamine‐Tetraacylated(Ac4ManNAz,#1084)や,N‐Acetylglucosamine(GlcNAc)やN‐Acetylgalactosamine(GalNAc)などのグリカンの標識に用いられるN-Azidoacetylglucosamine-Tetraacylated(Ac4GlucNAz,#1085)などがあります(これらの修飾糖化合物はキットには含まれていません。詳細はこちらをご覧下さい)。

キットに含まれるIsoTaG Probeは,通常の水素原子(H)を用いたもの[質量数:M]と,2つの重水素原子(D)で置換されたもの[質量数:M+2]があり,それぞれをクリック反応で,糖タンパク質に結合させます。
[質量数:M]と[質量数:M+2]のIsoTaG Probeは,1:1,1:2,1:3または1:4などの様々な比率で使用可能です。1:3の比率で用いた場合が,パターン認識において最も高いフィデリティを示しました。
IsoTaG Probeはビオチンを有するためストレプトアビジン-アガロースビーズとの結合により,試料中の糖タンパク質のみを濃縮することができます。濃縮後,リンカーを開裂することにより,ビーズを除去することができます。
ビーズを除去した糖タンパク質試料は,試料間でIsoTaG Probeによる質量数2の違いがあるため,これをMS解析時のレポーターとして用います。
Carolyn Bertozziらは,質量パターン予測(IsoStamp)と呼ばれる計算アルゴリズムの開発も行い,これを用いることで,MSのフルスキャン解析において,標識されたペプチド種の検出を可能にしました。

Comparison

ショットガンプロテオミクス法(従来法)とIsoTaG法


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IsoTaG Probeの基本構造

IsoTaG Probeには,クリック反応部位がアルキンのもの(アジド修飾糖タンパク質との反応用)と,アジドのもの(アルキン基修飾糖タンパク質との反応用)の2種類の製品があります。
いずれの製品も,図中のRがH:水素,D:重水素のものを組み合わせて用い,試料の標識を行います。

アジド修飾糖タンパク質との反応用(#1448

alkyne structure


アルキン修飾糖タンパク質との反応用(#1449

azide structure


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製品の種類

キットおよびIsoTaG Probe単品製品の商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

品名 Click-&-Go IsoTaG Kit
for Intact Glycopeptides Profiling
アジド修飾
糖タンパク質用
アルキン修飾
糖タンパク質用
商品コード 1448 1449
使用回数 25 tests*
キット
内容
DADPS H2/D2 Biotin Alkyne(#1451
DADPS H2/D2 Biotin Azide(#1450
Streptavidin agarose resin
Copper (Ⅱ) sulfate + Protectant
Reducing agent
Alkyne labeled BSA
5% formic acid

ビオチン最大濃度100μMで使用した場合の標識可能回数
キットには,クリック反応用の官能基を有する糖化合物(糖タンパク質修飾用),プロテアーゼインヒビター,ネガティブコントロール,プローブ解離試薬(Benzonase)などは含まれていません。また,On-resin解析を行う場合,DTT,ヨウ化アセトアミドなどの試薬が別途必要となります。詳細は各製品の製品データシートをご確認下さい。


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参考文献

  1. Woo, C.M., et al., "Development of IsoTaG, a Chemical Glycoproteomics Technique for Profiling Intact N- and O-Glycopeptides from Whole Cell Proteomess.", J. Proteome Res., 16 (4), 1706~1718 (2017). [PMID:28244757]
  2. Woo, C.M., et al., "Mapping and Quantification of Over 2000 O-linked Glycopeptides in Activated Human T Cells with Isotope-Targeted Glycoproteomics (Isotag).", Mol. Cell Proteomics., 17 (4), 764~775 (2017). [PMID:29351928]
  3. Gao, J., et al., "Small Molecule Interactome Mapping by Photoaffinity Labeling Reveals Binding Site Hotspots for the NSAIDs.", J. Am. Chem. Soc., 140 (1), 4259~4268 (2017). [PMID:29543447]
  4. Woo, C.M., et al., "Isotope-targeted glycoproteomics (IsoTaG): a mass-independent platform for intact N- and O-glycopeptide discovery and analysis.", Nat. Methods, 12 (6), 561~567 (2015). [PMID:25894945]
  5. Weerapana, E., et al., "Quantitative reactivity profiling predicts functional cysteines in proteomes." Nature, 468 (7325), 790~795 (2010). [PMID:21085121]

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価格

Click-&-Go IsoTaG Kit for Intact Glycopeptides Profiling

[在庫・価格 :2022年01月27日 09時51分現在]

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IsoTaG Kit for Intact Glycopeptides Profiling, for azide-modified glycoproteins, Click-&-Go
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IsoTaG Probeのみの単品別売品

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関連製品:クリック反応用の官能基を有する糖化合物(糖タンパク質修飾用)

あらかじめ細胞を培養する際に添加することにより,糖タンパク質をクリック反応用の官能基で修飾することができます。
製品の商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

構造式 品名 別名 M.W. 化学式 CAS No. 可溶性 商品
コード
Azido-Trehalose 6-Azido-Trehalose 6-TreAz 367.31 C12H21N3O10 水,DMSO, DMF 1472
Ac4GalNAz N‐Azidoacetylgalactosamine-Tetraacylated Ac4GalNAz 430.37 C16H22N4O10 653600-56-7 DMSO, DMF, MeOH, DCM, THF, Chloroform 1086
Ac4GlcNAz N‐Azidoacetylglucosamine-Tetraacylated Ac4GlcNAz 430.37 C16H22N4O10 98924-81-3 DMSO, DMF, MeOH, DCM, THF, Chloroform 1085
Ac4ManNAz" N‐Azidoacetylmannosamine‐Tetraacylated Ac4ManNAz 430.37 C16H22N4O10 361154-30-5 DMSO, DMF, MeOH, DCM, THF, Chloroform 1084
Kdo-N3 Kdo Azide Kdo-N3,
Ammonium 8-azido-3,8-dideoxy-D-manno-octulosonate
280.24 C8H16N4O7 1380099-68-2 水,DMSO, DMF, MeOH 1241
Ac4ManNAl N-(4-Pentynoyl)-Mannosamine Tetraacylated Ac4ManNAl 427.40 C19H25NO10 935658-93-8 DMSO, DMF, MeOH, DCM, THF, Chloroform 1154

クリック反応用の官能基を有する糖化合物の価格表

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6-Azide-Trehalose (6-TreAz)
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(テクニカルサポート 試薬担当)

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表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。