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ヒト細胞膜表面にエピトープをディスプレイするシステム tANCHOR Vector Kit

掲載日情報：2020/06/12 現在Webページ番号：68737

エーティージーバイオシンセティクス /
ATG:Biosynthetics GmbH
[メーカー略称：ATB]

目的のタンパク質・エピトープを新開発のtANCHORタンパク質との融合タンパク質として、ヒト細胞膜表面に発現・ディスプレイすることができるシステムです。細胞表面に発現させたtANCHOR融合タンパク質は、ELISAなどの生物学的分析、細胞表面におけるタンパク質間相互作用の研究または免疫研究における抗原発現システムに用いることができます。

※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

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tANCHORテクノロジーとは

tANCHORテクノロジーは、Dr. Daniel Ivanusic（独国ロベルト・コッホ研究所）によって開発されたエピトープを細胞膜表面にディスプレイするための革新的かつ用途の広いツールです。このシステムは、Ⅲ型内在性膜タンパク質であるテトラスパニンの4つの膜貫通ドメインの束（TM1～TM4）を改変した膜貫通アンカーであるtANCHORを使用します。tANCHORは、エピトープをヒト細胞の表面に非常に効率的に輸送することができます。

テトラスパニンタンパク質ファミリーは、4つの膜貫通ドメインと大小の細胞外ループ（SELおよびLEL）を有しています。tANCHORは、テトラスパニンのTM3とTM4ドメインを連結している大きな細胞外ループ（LEL）に代えて、エピトープなどの細胞表面に提示させたい完全または部分タンパク質のコード配列（CDS）を制限酵素部位EcoRⅠとEcoRⅤの間に配置することができます（図1参照）。

tANCHORテクノロジー1


図1 tANCHORテクノロジーの概略図

  • 左：テトラスパニンファミリーである野生型CD63タンパク質。細胞表面にSEL、LEL2種類のループを有している。
  • 右：tANCHOR融合タンパク質。LELが目的タンパク質に置換されている。

tANCHORテクノロジー2

図2 ヒト細胞表面におけるタンパク質・
エピトープのディスプレイ

目的の融合タンパク質は、細胞膜に効率的に輸送され、膜表面に固定されます。

tANCHORテクノロジー3

図3 HEK293T細胞表面上に発現させたmCherryの局在性の共焦点蛍光顕微鏡を用いた観察
目的タンパク質・エピトープのコード配列と併せて、C末端側にインフレームでmCherryのコード配列を組み込むことで、mCherryをトランスフェクションコントロールとすることが可能です。

  • 左：通常のベクターで発現させたmCherry。細胞質内全体で発現している。
  • 右：tANCHORと融合発現させたmCherry。細胞表面でのみ発現している。

※ mCherryの発現ベクターはクロンテック（タカラバイオ）より別途ご購入下さい。


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特長

  • 目的タンパク質・エピトープを天然の立体構造に近い形で細胞膜表面にディスプレイさせることができるため、抗体のスクリーニングに特に適しています。
  • 目的タンパク質発現細胞をそのまま用いてアッセイが行えるため、迅速かつ簡便にスクリーニングが行えます。
  • 宿主細胞での内在性CD63の発現量に併せて、CD63およびCD82ベースのtANCHOR発現ベクターからご選択いただけます。

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適用

  • 抗体のスクリーニング（特に、天然の立体構造をとる抗原を認識する抗体や中和抗体）
  • ヒト化抗体のアフィニティの確認
  • タンパク質間相互作用の研究

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製品の種類

キットには、各tANCHOR精製ベクター（TEバッファー／凍結乾燥品）と、Stabs（あらかじめプラスミドが組み込まれたE.coli）、またはその両方で供給されるものがあります。詳細は、下表をご覧下さい。商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

品名商品コードキット内容
精製ベクターStabs
tANCHOR-CD63
vector		tANCHOR-CD82
vector		tANCHOR CONTROL vectors
（6種)
tANCHOR Full set w/ StabsEX-TA-AL-ASA-1●●●8
tANCHOR Full set vectors onlyEX-TA-AL-ASA-2●●●－
tANCHOR Assay vectors onlyEX-TA-AL-ASA-3●●－2
tANCHOR All Stabs (only)EX-TA-AL-ASA-4－－－8
tANCHOR Individual Stabs of ControlsEX-TA-AL-ASA-5－－－1*

＊ 6種類のうちから、いずれか1種類のtANCHOR CONTROL vectorをご選択いただけます。

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キット構成品

tANCHOR Vector Kitを構成する単品の製品です。商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

種別品名商品コード包装
ACCEPTOR vectortANCHOR CD63/CD82 ACCEPTOR VectorsTA-CDA-ASA-11 set（各＞2μg）
tANCHOR CD63 ACCEPTOR VectorTA-CD63-ASA-11 vial（＞2μg）
tANCHOR CD82 ACCEPTOR VectorTA-CD82-ASA-1
CONTROL vectortANCHOR (-)FLAG CONTROL VectorTA-TG1-CON-1
tANCHOR (-)V5 CONTROL VectorTA-TG2-CON-2
tANCHOR (-)c-myc CONTROL VectorTA-TG3-CON-3
tANCHOR (-)Promoter CONTROL VectorTA-PM-CON-4
tANCHOR MAM CONTROL VectorTA-MAM-FL-5
tANCHOR pA0 CONTROL VectorTA-pA0-CON-6

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tANCHORコントロールベクターの種類と仕様

適用BoXエレメントタイプtANCHOR -Vectors
Control-1Control-2Control-3Control-4Control-5Control-6
タンパク質のディスプレイA-BoXCMV-WTエンハンサー＋＋＋－＋－
プロモーター＋＋＋－＋－
Leaderスタンダード＋＋＋－＋－
5'-FLAGエピトープタグ－＋＋＋－－
CD63 TM1-3膜貫通＋＋＋＋－－
Epitope PD-1エピトープタグ＋－＋＋－－
CD63 TM4膜貫通＋＋＋＋－－
3'-c-mycエピトープタグ＋＋－＋－－
BGHPolyA末端＋＋＋＋＋－
選択マーカーS-BoxAmpRFlexTECtype＋＋＋＋＋＋
転移T-Boxオプション－－－－－－
維持M-BoxCoIELvar.FlexTECtype＋＋＋＋＋＋

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ベクターマップ

tANCHORベクターbasic

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操作方法概略

  1. キットに含まれるptANCHOR CD63 ACCEPTOR vectorまたはptANCHOR CD82 ACCEPTOR vectorから、用いる細胞種に最適なベクターを選択する。HeLa細胞を標的とする場合には、ptANCHOR CD82の使用を、内在性CD63を多く発現している細胞を標的とする場合には、ptANCHOR CD63の使用を推奨する。
  2. 目的配列をptANCHOR CD63 ACCEPTOR vectorまたはptANCHOR CD82 ACCEPTOR vectorのEcoRⅠ/ EcoRⅤの制限酵素認識部位間にクローニングする。
  3. 構築したプラスミドDNAをヒト細胞にトランスフェクションする。
  4. エピトープタグ（FLAGまたはcMycタグ）に対する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、目的配列の発現確認を行う。
  5. 培養した細胞をそのまま用いてダイレクトELISA法で目的配列に対する抗体の結合を簡便に試験することができる。そのため、ペプチドをプレート表面にコートする必要はない（図4）。

ELISA


図4 ダイレクトELISA法による発現させたエピトープ配列に対する抗体の結合試験

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使用例

使用例1

本システムで発現させたHIV1エピトープの評価


HIV1由来の2種のエピトープ2F5、4E10とmCherryをtANCHORと融合発現させた。抗2F5抗体、抗4E10抗体それぞれと反応させたところ、素早いアクセスが確認された。

使用例2

融合エピトープの細胞表面での発現


HIV由来エピトープ、コントロールペプチドそれぞれとmCherryをtANCHORと融合させ、その蛍光を確認した。細胞表面でのみ発現していることが分かる。

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