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PCR, 大腸菌クローニングを超えるin vitro長鎖環状DNA構築ツール! OriCiro® Cell-Free Cloning System

掲載日情報:2020/09/07 現在Webページ番号:68153

OriCiro® Cell-Free Cloning Systemは立教大学の末次正幸教授の研究成果である多断片DNAの同時連結法(OriCiro® Assembly)と長鎖環状DNAの増幅法(OriCiro® Amp)を組み合わせた世界初の無細胞長鎖環状DNA構築ツールです。この新技術は従来の実験ワークフローを劇的に効率化し,かつ遺伝子工学の応用技術領域を大きく拡げます。
本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。


本技術は『実験医学』(羊土社)にて紹介されました!

「クローズアップ実験法:大腸菌いらずのセルフリー長鎖DNAクローニング」
奈良聖亜,末次正幸, 『実験医学』2020年4月号,Vol.38, No.6(羊土社)


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製品紹介動画


OriCiro® セルフリー・クローニングシステム
― 無細胞長鎖環状DNA構築システム ―

(約4分)


Webセミナー(2020.10.13開催の録画版)
「世界初のセルフリー長鎖環状DNA合成ツールのご紹介」

(約1時間)


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OriCiro® Cell-Free Cloning Systemの概要

つなげて ふやす
OriCiro® Assembly OriCiro® Amp
OriCiro Assemblyつなぐ 矢印 OriCiro Ampふやす
  • 最大50断片を同時に連結
  • 設計通り正確な連結
  • 30分の酵素反応のみ
  • 26種類のタンパク質から構成
  • 目的の環状DNAのみが選択的に増幅
  • 最大100万塩基対を増幅

本技術により複数のDNA断片を同時連結して環状化し,その環状DNAを選択的に増幅することがわずか2ステップの酵素反応で可能になり,従来の大腸菌を用いたDNAクローニングに要する日数や手間を大幅に削減できます。連結反応中に生じた環状化されていない直鎖DNAは増幅されることはありません。また,従来技術では増幅が困難なGCリッチや細胞毒性を有する遺伝子も効率的に増幅可能です。
OriCiro® Cell-Free Cloning Systemは,OriCiro® Assembly KitとOriCiro® Amp Kitから構成されており,この2つのキットを組み合わせてご使用いただくことで,最も高い性能を発揮できるようにデザインされています。


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OriCiro® Assembly ~DNAの連結環状化~


DNAの連結環状化の概要 反応条件:30~42 ℃,30 min.
相同配列:20~60 bp
  • 50断片までの同時連結が可能
  • 長鎖断片(50 kbまで)の連結が可能
  • 相同配列の位置は,末端から数十塩基離れていてもデザイン・連結が可能

OriCiro® Assemblyは,等温酵素反応と20~60塩基対の相同配列を介して複数のDNA断片を設計通りに連結し,最大50断片からなる多断片の同時連結や,50 kbまでの長鎖DNAの連結を可能にします。従来の相同末端を利用したシームレス連結法は熱によるアニーリングが必要でしたが,OriCiro® Assemblyではこの部分を酵素反応によって代替することで効率の良い連結を達成しています。相同配列のデザインに際してTm値を気にする必要がなく,マイルドな反応条件を構築することで,長鎖DNAが熱によって傷つくことも抑えられます。


0.6 kb×10断片の連結

OriCiro Assemblyで10断片連結の使用例
OriCiro Assemblyで10断片連結の模式図
  • Total 6 kb
  • 各断片には40 bpの末端相同配列をデザイン

OriCiro® Assembly
反応温度42℃
反応時間30 min

各0.6 kbの10断片をOriCiro® assemblyを用いて連結を行なった結果,10断片すべてを効率良く連結できることが示された。


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OriCiro® Amp ~環状DNA分子の指数増幅~


環状DNA分子の指数増幅

OriCiro® Ampは大腸菌の約500万塩基対のゲノムを複製するサイクルをin vitroで再構成した手法であり,26種類の複製に関与する精製タンパク質と染色体複製起点のoriC配列(約300 bp,OriCiro® Cell-Free Cloning Systemに付属)から構成されます。鋳型DNAの必要条件は環状でoriC配列を含むことのみで,この条件が満たされれば配列を選ばず,50 kbまでの長鎖環状DNAを増幅できます。環状であれば一本鎖のギャップやニックが入っていても修復されて増幅されます。
OriCiro® Assemblyで調製した環状DNAが1分子あれば,in vitroで複製サイクル反応が等温で自律的に繰り返し,短時間で10μl反応あたり最大1μgの長鎖環状DNAがスーパーコイル型として得られます。


10 kb環状DNAの増幅

10 kb環状DNAの増幅

■ 高効率な増幅

  • 倍加時間5分。
  • 1分子のDNAが,3時間で10億倍以上に増幅。

10 kb環状DNAを用いた場合。
OriCiro® Assemblyによる連結産物から増幅する場合は,6時間かかります。

■ 非常に高い正確性

  • 10-8 エラ-/塩基/サイクル
  • PCRの100~10,000倍

10 kbのoriC環状DNAが30℃のOriCiro® Amp反応によって環状分子として指数増幅されます。


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技術の特長

OriCiro® Assembly

  • 等温酵素反応による効率的な連結が可能です。
  • 50個までのDNA断片を一度に設計通り正しく同時連結することができます。
  • 50 kbまでの長鎖DNAの連結も可能です。

OriCiro® Amp

  • 大腸菌ゲノム複製システムを試験管内で再現しました。
  • 1分子の環状DNAを数時間の等温反応で数十億倍以上に増幅します。
  • 1 Mbを超える長鎖環状DNAの増幅をin vitroで実現しました*1
  • 増幅正確性はPCR法(Taqポリメラーゼ)の最大1万倍です。
  • 新たな反応液に継代することで,何世代も増幅を継続可能です。
  • 増幅産物は大腸菌への形質転換が可能です。
  • PCRや大腸菌では困難なGCリッチや細胞毒性をもつ配列も増幅可能です。

*1 参考文献1参照。本製品は最大50 Kbの長鎖環状DNAの増幅に最適化されています。さらに長い環状DNAの増幅をご希望される場合はオリシロジェノミクス株式会社(product@oriciro.com)にお問い合わせ下さい。


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本増幅技術と従来法との比較

大腸菌を使った
DNAクローニング
PCR法 本技術
RCR法
DNAサイズ 5万塩基対まで 1万塩基対まで 5万塩基対まで
(ゲノムレベル)
複製エラー 10-10
エラ-/塩基
10-4 ~ 10-6
エラ-/塩基
10-8
エラ-/塩基*2
操 作 時間(数日)と手間・培養技術・設備が必要

DNAクローニング概略
熱サイクルが必要

PCR概略
等温で温めるだけ
オートメーション化も容易


RCR法概略

最終産物は単量体の環状DNA
バイオ
セーフティー
遺伝子組換え実験 細胞は使わない 細胞は使わない
増幅困難性 細胞毒性のために増幅困難な配列が多い
組換えによるリピート配列の脱落
GCリッチな配列やリピート配列は増幅困難 DNA配列を選ばず
細胞毒性の問題なし

*2 大腸菌レベルのエラー率を実現するために技術開発中です。


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使用例

OriCiro® Cell-Free Cloning Systemを用いた8 kb環状DNAの増幅

OriCiroで8kb増幅ベクターマップ
OriCiroで8kb増幅模式図
OriCiroで8kb増幅結果

7.5 kb DNA断片(1 ng)*4 と,この断片の両末端に対する40 bpの相補的なオーバーラップ配列をデザインした0.4 kb oriC cassette (50 pg)*4をOriCiro® Assembly反応(5μl)にアプライし,42℃で30分間インキュベートした。その後,1μlのassembly反応液(+)またはassembly反応を行っていない同量のDNA溶液(-) をOriCiro® Amp反応(10μl) に添加し,33℃で6時間インキュベートした。この反応液を用いてアガロースゲル電気泳動を行った結果,assembly反応液を添加した試料でのみ,8 kbの増幅産物が環状のスーパーコイル分子として検出された。
*4 これらのDNAはOriCiro® Cell-Free Cloning Kitに“Control fragment”と“oriC cassette”として含まれています。


OriCiro® Amp Kitを用いた50 kb環状DNAの増幅

OriCiroで50kb増幅結果

oriC配列を含む50 kb環状DNA(5 ng) をOriCiro® Amp反応(10μl) に加え,33℃で6時間インキュベートした。その結果,複製中間体は生成されているもののスーパーコイル分子が検出できなかった(-)ため,反応液をOriCiro® Ampバッファーで2倍希釈した後,33℃で30分間インキュベート(Finalization option) すると,通常のアガロースゲル電気泳動で分離可能なサイズの50 kbの環状DNAのスーパーコイル分子が生成された(+) 。


51個のDNA断片からの27 kb環状DNAの構築例

OriCiroで51断片連結のベクターマップ
OriCiroで51断片連結の模式図
OriCiroで51断片連結の結果

各断片に60 bpの相補的なオーバーラップ配列を持たせ,各断片がすべて連結されると27 kbの環状DNAとなるようにデザインした,0.6 kbのDNA断片を51個調製した。最初に断片のプール(total 20 ng) をOriCiro® Amp反応(5μl) に加えて,42℃で30分間インキュベートし,さらに65℃で2分間の熱処理を行った。その後,1μlの反応液をOriCiro® Amp反応(10μl) に加えて,30℃で6時間インキュベートした。この反応液をOriCiro® Amp bufferで2倍希釈し,30℃で30分間さらにインキュベートした(Finalization option) 。反応産物をアガロースゲル電気泳動した結果,27 kbのスーパーコイル型DNAが構築され,増幅されていることが確認できた。


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アプリケーション例

  • 手間と時間のかかる大腸菌クローニングの代替
  • 複数DNA断片の連結によるウイルスベクター/プラスミドの構築
  • PCRでは増幅困難な長鎖DNAの増幅
  • 毒性等の原因により大腸菌では困難なDNA配列のクローニング
  • PCRや大腸菌では困難なGC-rich配列のクローニング
  • 組換えファージの作製

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OriCiro® Cell-Free Cloning Systemに関するFAQ

OriCiro® Cell-Free Cloning Systemに関するFAQ(クリックで展開します)

Q-1. 連結産物の保存はどのようにすれば良いですか?

A-1. 4℃で2,3日保存可能です。長期保存する場合は,終濃度5 mMのEDTAを添加して-20℃で凍結保存して下さい。OriCiro® Ampによる増幅の際には10倍希釈されるため,EDTAの終濃度は0.5 mMとなり増幅反応に影響はありません。



Q-2. 連結反応後にOriCiro® Ampによる環状 DNA 増幅反応を行う場合,精製は必要ですか?

A-2. 不要です。保温後の連結反応液(1μl)を直接OriCiro® Amp増幅液(トータル 10μl)に添加します。連結反応により生じた環状DNA量がわずかであっても,OriCiro® Ampにより目的の環状化DNAを選択的に増幅可能です。連結反応の中間産物である直鎖状DNAは増幅されません。



Q-3. 制限酵素やCRISPR-Cas9による切断DNA断片も連結することは可能ですか?

A-3. 可能です。



Q-4. 連結反応がうまくいきません。

A-4. 連結反応はDNA試料の塩やEDTA濃度が非常に高い場合,阻害されることがあります。



Q-5. 増幅産物の保存はどのようにすれば良いですか?

A-5. 4℃で2, 3日保存可能です。長期保存する場合は終濃度20 mMとなるようにEDTAを加えてから,-20℃で凍結保存して下さい。なお,50 Kb以上の長鎖環状DNAは凍結により切断されますので,フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿を行い,精製DNAを4℃で保存して下さい。



Q-6. 増幅産物を大腸菌形質転換できますか?

A-6. はい。化学的形質転換には増幅反応液を精製せずに直接使用可能です。エレクトロポレーションの場合は,増幅反応液をddH2Oで10倍希釈して塩濃度を下げる必要があります。増幅産物は大腸菌内では低コピーoriCプラスミドとして自律複製します。形質転換の際には目的の環状DNAに選択マーカーが含まれていることをご確認下さい。OriCiro® Cell-Free Cloning System付属のControl fragmentにはクロラムフェニコール耐性遺伝子が含まれますので,コントロール産物で形質転換をお試しいただけます。



Q-7. 目的とは異なるDNAが増えてしまいました。

A-7. 次の問題点が考えられます。

  1. 増幅反応液にDNAがコンタミネーションしている。
    鋳型oriC環状DNAを加えないネガティブコントロールを設定して下さい。1分子の環状DNAからでも増幅するため,できるかぎりDNAフリーの環境で実験して下さい。
  2. 鋳型DNA調製で,目的外の連結産物ができている。
    非特異的なPCR増幅産物が連結している可能性があります。ネガティブコントロールとして連結反応を行なっていないDNA断片等も増幅反応を行なうことでコンタミネーションの有無をご確認下さい。


Q-8. 増幅が見られません。

A-8. 以下を検討してみて下さい。

  1. 反応温度を37℃に上げる。
  2. 用いる鋳型量を増やす。
  3. 反応時間を最大18時間に伸ばす。
  4. DNAを加える直前に,反応液を30℃で15分間プレインキュベートするステップを追加する。

本キットのマニュアルに記載しているプロトコルでは最大50 Kbの環状DNAの増幅が可能です。さらに長い環状DNAの増幅をご希望される場合はオリシロジェノミクス株式会社(product@oriciro.com)にお問い合わせ下さい。



Q-9. 得られた増幅産物を再増幅することは可能ですか?

A-9. はい。新たな増幅反応液に希釈し,再保温することで,10回以上継代して再増幅できることを確認しています。

環状DNA増幅液の継代

環状DNA増幅液の継代


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参考文献

  1. "Overcoming the Challenges of Megabase-Sized Plasmid Construction in Escherichia coli."
    Mukai, T., et al., ACS Synth. Biol., 9 (6), 1315 (2020). (doi: 10.1021/acssynbio.0c00008) [PMID:32459960]
  2. "Efficient Arrangement of the Replication Fork Trap for In Vitro Propagation of Monomeric Circular DNA in the Chromosome-Replication Cycle Reaction."
    Hasebe, T., et al., Life (Basel), 8 (4), 43 (2018). [PMID:30257439]
  3. "Exponential propagation of large circular DNA by reconstitution of a chromosome-replication cycle."
    Su'etsugu, M., et al., Nucleic Acids Res., 45 (20), 11525 (2017). [PMID:29036468]

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キット内容

キット名 OriCiro®
Cell-Free Cloning System 1.0
OriCiro®
Amp Kit 1.0
商品コード MS0011-A MS0021-A
OriCiro® Assembly
(5反応分,5μl/反応)
OriCiro Assembly 2×RA mix
OriC cassette(50 pg/μl)
Control fragment(1 ng/μl)
OriCiro® Amp
(10反応分,10μl/反応)
OriCiro Amp 10×RE mix
5×BufferⅠ (20μl×2 vials)
5×BufferⅡ (20μl×2 vials)


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製品外観

OriCiro Cell-Free Cloning System外観

OriCiro® Cell-Free Cloning System 1.0
(#MS0011-A)

OriCiro Amp Kit外観

OriCiro® Amp Kit 1.0
(#MS0021-A)



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価格


本製品のご購入について

本製品は,非営利団体(大学・研究機関)にご所属のユーザーのみが購入可能な製品となります。また,ご購入時には専用の同意書に必要事項をご記入いただき,販売店担当者にお渡し下さい。
なお,企業・営利団体にご所属の方がご購入希望の場合は,オリシロジェノミクス株式会社(product@oriciro.com)までお問い合わせ下さい。


[在庫・価格 :2020年10月23日 16時51分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
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納期 文献数
OriCiro Cell-Free Cloning System 1.0 (Assembly 5reactions, Amp 10reactions)
ご照会下さい  0
説明文
多断片DNAの同時連結法と長鎖環状DNAの増幅法を組み合わせた無細胞長鎖環状DNA構築ツール。増幅が困難な反復配列や細胞毒性を有する遺伝子も効率的に増幅可能。 ※非営利団体(大学・研究機関)のユーザーのみ購入可能。※購入時に専用の同意書が必要。※企業・営利団体に所属のユーザーが購入希望の場合は,オリシロジェノミクス株式会社までお問い合わせ下さい。
法規制等
保存条件 -80℃ 法規備考
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OriCiro Amp Kit(10reactions) 1.0
ご照会下さい  0
説明文
環状DNAを増幅するキット。100万塩基対といった長大な環状DNAも増幅できる。 ※非営利団体(大学・研究機関)のユーザーのみ購入可能。※購入時に専用の同意書が必要。※企業・営利団体に所属のユーザーが購入希望の場合は,オリシロジェノミクス株式会社までお問い合わせ下さい。
法規制等
保存条件 -80℃ 法規備考
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[在庫・価格 :2020年10月23日 16時51分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。

OriCiro Cell-Free Cloning System 1.0 (Assembly 5reactions, Amp 10reactions)

文献数:0

  • 商品コード:MS0011-A
  • メーカー:ORC
  • 包装:1kit
  • 価格:¥50,000
  • 在庫:無(発注済)
  • 納期:ご照会下さい 
  • 法規制等:

説明文 多断片DNAの同時連結法と長鎖環状DNAの増幅法を組み合わせた無細胞長鎖環状DNA構築ツール。増幅が困難な反復配列や細胞毒性を有する遺伝子も効率的に増幅可能。 ※非営利団体(大学・研究機関)のユーザーのみ購入可能。※購入時に専用の同意書が必要。※企業・営利団体に所属のユーザーが購入希望の場合は,オリシロジェノミクス株式会社までお問い合わせ下さい。
法規制等
保存条件 -80℃ 法規備考
掲載カタログ

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OriCiro Amp Kit(10reactions) 1.0

文献数:0

  • 商品コード:MS0021-A
  • メーカー:ORC
  • 包装:1kit
  • 価格:¥45,000
  • 在庫:無(発注済)
  • 納期:ご照会下さい 
  • 法規制等:

説明文 環状DNAを増幅するキット。100万塩基対といった長大な環状DNAも増幅できる。 ※非営利団体(大学・研究機関)のユーザーのみ購入可能。※購入時に専用の同意書が必要。※企業・営利団体に所属のユーザーが購入希望の場合は,オリシロジェノミクス株式会社までお問い合わせ下さい。
法規制等
保存条件 -80℃ 法規備考
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(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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