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幹細胞(MSCまたはiPS細胞)用の三次元(3D)培養容器 CELLvo Matrix/CELLvo XF Matrix/CELLvo Matrix Plus コート済みプレート/フラスコ

掲載日情報:2021/06/08 現在Webページ番号:67754

ヒト細胞由来の細胞外基質(CELLvo Matrix)があらかじめコーティングされた培養器材(プレート/フラスコ)です。
MSC用のCELLvo Matrixと,iPS細胞由来心筋細胞の培養用のCELLvo Matrix Plus製品があります。

CELLvo Matrix

CELLvo Matrixの電子顕微鏡像

CELLvo XF Matrix

CELLvo XF matrixの電子顕微鏡像

幹細胞および分化細胞の培養における課題

①iPS細胞の培養における課題

iPS細胞の培養には煩わしい点が多々あります。

  • 従来のプラスチック製のプレートやフラスコは,本来幹細胞が存在する環境とは異質であり,コラーゲンやMatrigelでコーティングしても一部の培養細胞しか接触できず,生体内環境に近い条件で培養することは困難
  • 培養基質があらかじめコーティングされたプレートは,通常使用期限が短い
  • 特に96ウェルプレートなど,小さなウェルに自分でマトリックスのコーティング処理を行うのは面倒

CELLvo Matrixシリーズは上記の問題を解決します。

②iPS細胞由来心筋細胞の培養における課題

創薬基礎研究や前臨床段階の薬効評価・安全性スクリーニングでは,どのようにして成熟状態のiPS細胞由来心筋細胞を得るか,という課題があります。
多くの研究グループでは,電気刺激(electrical pacing)を与えたり,機械的な刺激を与えた三次元マイクロ組織(3-D microtissues with mechanical stimulation)を使ったり,またはとても長い培養期間の経過をもって成熟していると見なしたりすることで対応しているようです。

CELLvo Matrix Plusは二次元培養で心筋細胞を成熟させるのに適しています。市販されているiPS細胞由来心筋細胞を本製品CELLvo Matrix Plusに播種すると,自発的に整列し,構造的に成熟状態となります。(CELLvo Matrix Plusの使用例)参照

③CELLvo Matrix Plusで増殖したhiPSC-CM

Cartoxの創設者であるミシガン大学のTodd Herron博士と,StemBioSys社のChief Technology OfficerであるTravis Block博士が共同研究に関して討議したビデオです。Herron博士は,この共同研究の実験や,hiPSC-CMの成熟の成功とその後の開発初期段階での薬剤の心臓における安全性を予測的に試験する能力など,製薬業界にとって有用ないくつかの長所について簡単に解説しています(約1時間)。


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特長

  • 幹細胞を自然な状態で培養・増殖することができます。
  • PBSまたは培養液を用いて37℃で1時間再水和してから使用します。
  • 自分でコーティングを施したプレートよりもiPS細胞の生存率を上げることができ,時間も節約できます。
  • 従来のプラスチック製の培養容器に比べ,よりサイズが小さく,増殖能が高く,かつ未分化状態を維持した高品質の幹細胞を得ることができます。
  • 脂肪,骨髄,臍帯血など様々な組織由来の間葉系幹細胞の分離・培養が可能です。
  • 6ウェルプレート,96ウェルプレート(CELLvo Matrix Plusのみ),T75フラスコ,T150フラスコのラインナップがあります。
  • 滅菌済みです。
  • 動物成分を含まないゼノフリーの製品CELLvo Xeno Free Matrixもあります。

CELLvo Matrixとは

  • CELLvo Matrixは,生体内において幹細胞が存在する微小環境を生化学的および構造的に厳密に模倣した間葉系幹細胞(MSC)用基質です。
  • 特許取得済み US Patent numbers: 8,084,023 ; 8,388,947 ; 8,961,955 and EP2414511B1.


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製品ラインナップ

商品コードをクリックすると各製品の価格表をご覧いただけます。

CELLvo 品名 細胞外基質の由来 適した細胞種 ゼノ
フリー
培養容器/商品コード

6-wellプレート

6-wellプレート

T75フラスコ

T75フラスコ

T150フラスコ

T150フラスコ

Matrix 骨髄間質細胞(BMSC) 間葉系幹細胞(MSC) CELLvoMatrix-6WP CELLvoMatrix-T-75 CELLvoMatrix-T-150
Xeno Free Matrix CELLvoXFMatrix-6WP CELLvoXFMatrix-T-75 CELLvoXFMatrix-T-150
Matrix Plus ヒト周産期幹細胞(Perinatal Stem Cells) iPS細胞由来の心筋細胞 AF-HPME-6WP AF-HPME-T75 AF-HPME-T150


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使用例

画像をクリックすると,拡大画像をご覧いただけます。

CELLvo Matrix

14日目の初代骨髄単核細胞(100×)からのBM-MSC分離

CELLvo Matrix使用例1

ヒトや動物の組織から初代細胞を分離・培養する際,細胞を外来基質(foreign substrates)へ接着させるために,通常高濃度のFBSが必要になる。CELLvo XF Matrixを使用すると,細胞は自然に落ち着き(home),新しい微小環境に付着する。初代細胞のより迅速な付着と増殖が可能になる。


プラスチック製組織培養プレート(TCP)または CELLvo Matrixに播種した後の細胞の遺伝子発現のヒートマップ

CELLvo Matrix使用例2

培養されていた微小環境から細胞が取り出されると,遺伝子発現が変化する。単純な基質(プラスチック)に播種すると,マトリクソームタンパク質(全細胞外マトリックス)の遺伝子発現が活発になる。CELLvo Matrix上では,細胞はより自然な遺伝子発現を保持し,培養期間中に表現型を維持する。これにより,継代を繰り返してもより健康な細胞を維持したり,細胞の表現型に注目する実験を進めたりすることができる。


CELLvo Matrix(100×)で培養中の羊膜MSC

CELLvo Matrix使用例3

培養容器の底にコーティングされた基質の薄い層は光学的に透明である。細胞は上部の単層で成長し,美しい明視野イメージングを可能になる。CELLvoMatrixで培養している細胞を直接染色し,蛍光イメージングも可能。
FITCまたはAlexaFluor 488は,プラスチック製ディッシュ由来のバックグラウンド蛍光を示す場合がある。


CELLvo Matrix Plus

CELLvo Matrix(100×)で培養中の羊膜MSC

CELLvo Matrix Plus使用例1

市販培地とCELLvo Matrix Plusで培養した幹細胞の自己複製

  • 上段:iPS-Brew(Miltenyi Biotec社)
  • 下段:StemFlex(Thermo Fisher Scientific社)を使用

CELLvo Matrix Plusに播種して7日後 のiPS細胞由来心筋細胞(CDI)

CELLvo Matrix Plus使用例2

iPS細胞由来心筋細胞をCELLvo Matrix Plusに播種した。自発的に整列し,構造的に成熟状態となっている。

CELLvo Matrix Plus使用例3

CELLvo Matrix PlusにiPS細胞由来心筋細胞を播種した。その後7日目の間に,多くが二核化し,桿状となった。これらは従来法で培養した場合にはほとんど見られない成熟マーカーである。


CELLvo Matrix Plusで培養したMSC

CELLvo Matrix Plus使用例4

CELLvo Matrix Plusで培養したMSCは自己複製と分化のポテンシャルがTCPに比べて向上した。CELLvo Matrix Plusプレートの方が優れたコロニー形成能(CFU-F)を示し,脂肪細胞(CFU-AD)や骨芽細胞(CFU-OB)への分化も優れていた。さらに,CELLvo Matrix Plusでは他の基質と比較してMSCの増殖が劇的に増加した。


CELLvo Matrix Plus上で培養した心筋細胞

CELLvo Matrix Plus使用例5

CELLvo Matrix Plus上で培養した心筋細胞は,7日後に構造的に成熟し,高度に組織化された単層を形成した。
ファロイジン染色により,Matrigelで培養した心筋細胞に比べて,細胞内と単層内で細胞骨格要素がきちんと整列しているのがわかる。さらに, CELLvo Matrix Plusで培養した心筋細胞はMatrigelで培養した細胞に比べて均一にCardiac troponin I (cTnI)を高発現している。なお,培養前(prenatally)には本遺伝子の発現は見られない。


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CELLvo Matrixプレートと各種培養用プレートを用いた比較実験

骨髄単核細胞からの間葉系幹細胞(MSCs)の分離

CELLvo Matrix

骨髄単核細胞を播種してから14日後の顕微鏡画像
ヒト骨髄単核細胞を5 x 105 個/cm2の密度で各培養器材に播種し,14日間培養した。CELLvo Matrix上に分離したMSCは,サイズがより小さく,密集した単層を形成している。他の基質上の細胞は数がかなり少なくなっている。


骨髄単核細胞から14日培養後の初代細胞数の比較

CELLvo Matrix

CELLvo Matrixは他の基質より細胞数が非常に多く(p<0.05),MSC用基質と幹細胞用基質の細胞は組織培養プレートより少ない細胞数になっている(p<0.05)。
*=p<0.05 vs. TCP, t-test. N=3


分離した骨髄間葉系幹細胞(BM-MSCs)の増殖能の確認

上記のように分離した骨髄間葉系幹細胞を6,000 個/cm2の密度で各培養器材に播種し,4日間培養した。細胞の個数は未分化マーカーのSSEA-4を発現している細胞のパーセンテージをかけて算出した。

CELLvo Matrix

経代4日後の骨髄間葉系幹細胞(BM-MSCs)
4日後にCELLvo Matrix上のBM-MSCは迅速にコンフルエントに達し,小さな紡錘状の形態を維持している。一方,組織培養プレートやコラーゲンコートは大きく広がった。


SSEA-4を発現する骨髄間葉系幹細胞(BM-MSCs)数の比較(培養4日後)

CELLvo Matrix

CELLvo Matrixは他の基質より細胞数が著しく多く(p<0.05),MSC用基質の細胞は他の基質より少ない細胞数になっている(p<0.05)。
*=p<0.05 vs. TCP, t-test. N=3


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CELLvo Matrix で培養した幹細胞のタイムラプス観察動画


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製造工程

CELLvo Matrixとは

十分量増殖させた骨髄細胞に刺激を加え,細胞外基質CELLvo Matrixを産生させる。その後,細胞を穏やかに取り除くことで,CELLvo Matrixがコートされた培養容器が作製できる。


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アップリケーションプロトコル

アプリケーションプロトコル

上のイメージをクリックすると,アプリケーションプロトコルをダウンロードできます(アプリケーションプロトコル)。


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FAQ

CELLvo Matrix のFAQ (クリックで展開します)

Q-1. CELLvo Matrixの厚さはどれくらいですか?

A-1. 厚さは一定でないものの,5~40 μmの範囲内です。CELLvo Matrixは培養基の表面上に形成されます。


Q-2. CELLvo Matrixは取り扱い上,十分強固ですか?

A-2.いいえ,細胞からの分泌タンパク質複合体で,強固ではありません。


Q-3. 同様の他社製品と比較して,優位点は何ですか?

A-3. CELLvo Matrixは細胞由来の生体模倣基質(biomimetic substrate)です。そのため, in vivoに近い環境で培養することができます。CELLvo Matrixで培養した細胞は,異質な(foreign)微小環境に対してはあまり反応せず(not “busy” responding),外界刺激に対する応答性が高くなります。つまり,CELLvo Matrixで培養した細胞は,人工基質で培養された細胞よりも実験変数(experimental variables)に応じた反応を見せると言えます。この状況はニ次元培養や複数のマトリックスタンパク質がコーティングされたプレートでの培養では再現できません。


Q-4.CELLvo Matrixの構成タンパク質はどのくらいあるのでしょうか?

A-4. 細胞由来のため,CELLvo Matrixに存在している細胞外マトリックスタンパク質は非常に複雑です。他の研究室の研究によると,150種以上とのことです。


Q-5.CELLvo Matrixは完全に特徴づけられていますか?

A-5. CELLvo Matrixはヒト幹細胞由来のため,ロット差の存在が予想されます。しかし,特定のタンパク質の正確な濃度はそれぞれ異なると思われますが,最も濃度の高いタンパク質は一貫して同一です。私たちが行った品質保証テスト(成体幹細胞の培養)でも,すべてのロットで同様の良い結果(similar positive impact)が見られました。


Q-6.CELLvo Matrixは細胞の挙動や運動性に影響しますか?

A-6. 細胞に与える影響は,細胞のタイプにより異なります。間葉系幹細胞(MSC)に対しては,細胞増殖と運動性を向上し,一方細胞外マトリックスタンパク質の合成は減少します。


Q-7.細胞は,CELLvo Matrixのどの箇所に生着してしますか?

A-7. 細胞の種類によって異なります。CELLvo Matrixの内部あるいは下部で生着したり,遊走してCELLvoマトリックスの表面上で増殖する細胞もあります。


Q-8.CELLvo Matrixからどのようにして細胞を剥離できますか?

A-8. これは研究者ご自身でご検討いただく必要があります。一般的にコラゲナーゼのトリプシンによる酵素消化は効果的です。


Q-9.CELLvo Matrixで細胞を培養できる期間はどれくらいですか?

A-9. 細胞を100%コンフルエントを超えて培養した場合,培養表面からマトリックスが剥がれる場合があります。


Q-10.製品は滅菌済みですか?

A-10. はい,電子ビーム照射による滅菌済みです。


Q-11.保存方法は?

A-11. 冷蔵保存(4~8℃)して下さい。室温でもごく限られた時間なら材料の性能には影響しません。


Q-12.未使用製品に,CELLvo Matrix産生細胞が付着したまま残っていることはありますか?

A-12. いいえ,CELLvo Matrix産生細胞は,最終工程で除去されます。


Q-13.CELLvo Matrix中にDNAは残存しますか?

A-13. 微量の残存DNAが存在する可能性はあります。研究上ご心配な場合は,使用前にDNaseで短時間インキュベーションすることをお勧めします。


Q-14.GMPグレードですか?

A-14. いいえ。現段階では研究用として製造していますが,将来のGMPグレード製品を見据えて製品はクラス100(ISO 5)のクリーンルームで製造されています。


Q-15.Matrigelとの違いは何ですか?

A-15. Matrigelは主にiPS細胞の培養に使われますが,うまく培養できない細胞も存在します。Matrigelはマウス細胞由来,CellVo Matrixはヒト細胞由来です。


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参考文献

  • Shakouri-Motlagh, O’Connor, Brennecke, Acta Biomater., 55:1~12 (2017).
  • Lai, Y. et al., Stem Cells and Dev., 19(7):1095~1107 (2010).
  • Chen X., Birth Defects Res. C Embryo Today, 90(1):45~54 (2010).
  • Marinkovic M, Block TJ, Rakian R, et al., Matrix Biol., 52~54:426~441 (2016).

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価格

CELLvo Matrix

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CELLvo Matrix, 6-well plate
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CELLvo Matrix, 75cm2 t-flask
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CELLvo XF (ゼノフリー)Matrix

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CELLvo Xeno Free Matrix, 6-well plate, humanized version of the CELLvo Matrix
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CELLvo Human Mesenchymal Stem Cell (MSC)
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CELLvo Matrix Plus

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CELLvo Matrix Plus, 96 Well plate

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CELLvo Matrix Plus, 75cm2 T-Flask

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