HOME> 試薬> 遺伝子工学> PCR・シークエンシング> RT-PCR用製品> ThermaStop-RT

高い感度,特異性および収量が得られるRT-PCR用添加剤 ThermaStop-RT

掲載日情報:2018/10/12 現在Webページ番号:67634

ThermaStop-RTは,One-StepまたはTwo-Step RT-PCRにおいて,バッファーに加えることにより,感度,特異性およびRT-PCR産物の収量を向上することができる添加剤です。
低温で逆転写酵素に作用し,プライミングエラーを低減します。これにより,RT-PCRにおける非特異的産物の産生が抑制され,検出感度および特異的産物の収率が大幅に向上します。

シグナル強度の比較

左:ThermaStop-RT 未使用または使用したTwo-Step RT-PCRおよびOne-Step RT-PCRにおけるHepatitis C Virus(HCV)のRNA配列検出シグナル強度の比較
ThermaStop-RTを使用した場合(TS-RT)では,未使用の場合(no TS-RT)に比較して,Two-Step RT-PCRおよびOne-Step RT-PCRの両方において著しい検出シグナルの増加が見られた。

右:One-Step RT-PCRにおけるThermaStop-RT の非特異的RT-PCR産物の抑制効果
ThermaStop-RTを使用した場合(#6~#10レーン)では,152と125塩基対の特異的なRT-PCR産物のバンドのみが確認されるが,ThermaStop-RT未使用の場合(#1~#5レーン)では,152と125塩基対のRT-PCRの特異的産物が減少する一方で,多数の非特異的産物の産生されることを確認した。

レーン#1,#6:パームヤシ葉由来のミトコンドリアのnad5 mRNA
レーン#2,#7:合成パームヤシウイロイドRNA
レーン#3~#5,#8~#10:nad5 mRNAに異なる希釈率でtennしたウイロイドRNA
M:定量的DNAラダー(100~500塩基対)

製品の種類

品名または商品コードをクリックすると,価格表をご覧いただけます。

品名 ThermaStop-RT
商品コード rtTS-250 rt-TS-1250
包装 250 units 1,250 units

1 unitのThermaStop-RTは,20μl中に50 unitsのMMLV(マウス白血病ウイルス)由来の逆転写酵素と1unitのホットスタートTaqポリメラーゼを含む混合液を用いて逆転写反応を50℃で実施し,RT-PCRにおいて最適性能が得られる添加量として定義されます。

目次に戻る

特長

  • すべての標的RNAの逆転写反応を改善できます。
  • 低コピーの標的の検出または複数のプライマーペアを含むマルチプレックスアッセイにおいて,特に有用です。
  • 非特異的な増幅を大幅に減少するため,ThermaStop-RTを用いたRT-PCR後のシークエンシングの結果が向上します。

ThermaStop-RTは,ThermaStopまたはThermaGoと併用しないで下さい。
本品はMMLV(マウス白血病ウイルス)由来の逆転写酵素と,ホットスタートタイプのTaqポリメラーゼとの組み合わせで検証済みです。

目次に戻る

ThermaStop-RTの使用例

ThermaStop-RTの使用例 (クリックで展開します)
ThermaStop-RTの使用例   ThermaStop-RT Acts Like a Hot-Start for Reverse Transcriptases when a Two-Step RT-PCR Protocol is Used
In the two-step RT-PCR reactions shown here, reverse transcriptases from two manufacturers were used. One was derived from Murine Myelocytic leukemia virus and one from Avian Myelocytic leukemia virus. In absence of ThermaStop-RT (No TS-RT) both enzymes synthesized high levels of non-specific products which were then amplified during PCR, the second step of the reaction. In contrast, addition of ThermaStop-RT (TS-RT) prior to the first step resulted in the correct product at high levels.
 
ThermaStop-RTの使用例   ThermaStop-RT Acts Like a Hot-Start for Reverse Transcriptases when a One-Step RT-PCR Protocol is Used
In the one-step RT-PCR protocol used here reverse transcription was carried out at either 50 degrees or 55 degrees. Incubation at the higher temperature slightly reduced the amplification of non-specific products, but did not significantly increase the yield of the correct products. In contrast, addition of ThermaStop-RT resulted in very clean correct product at high yield. It is now seen that 50 degrees is better than 55 degrees because the reverse transcriptase is more stable at the lower temperature.
 
ThermaStop-RTの使用例   ThermaStop-RT Significantly Improves Multiplexing and Sensitivity in One-Step RT-PCR
One-step RT-PCR was carried for a housekeeping mRNA in plant cells (target 1, 152 bp product) and a plant viroid RNA (target 2, 127 bp product). The RNA for target 2 was added to lanes A,B, C at 10-fold decreasing amounts. In the absence of ThermaStop-RT, the primers for target 1 also reverse transcribed many non-specific RNAs present in the preparation of total cellular RNA. In contrast, in the presence of ThermaStop-RT the primers for target 1 were highly specific. Moreover, in the absence of ThermaStop-RT very little-to-no target 2 RNA was reverse transcribed and amplified. In contrast, in the presence of ThermaStop-RT target 2 RNA was reverse transcribed and amplified efficiently, at all dilutions of input RNA (1,000 copies, 100 copies, 10 copies).
 
ThermaStop-RTの使用例   ThermaStop-RT Significantly Improves Quantitative Accuracy in One-Step RT-PCR
One-step RT-PCR was carried out using real-time PCR and the amount of the product was measured with a TaqMan probe for the hepatitis C virus product. Five replicate reactions were used at each step in a 10-fold dilution series starting at 40,000 viral genomes and going down to 40 viral genomes per reaction. In the absence of ThermaStop-RT (upper panel) the signal from the 40,000 copies came up at cycle 30 and lower levels of starting copies became more and more scattered and thus, quantitatively meaningless. In contrast, in the presence ThermaStop-RT the signal came up 5-6 cycles earlier, the replicates were very consistent and quantitatively accurate all the way down to 40 copies. This is a quantitative demonstration of the fact that ThermaStop-RT prevents amplification of non-specific products during reverse transcription and hence increase the yield of correct products and the sensitivity of RT-PCR reactions.


目次に戻る

操作方法概略

ThermaStop-RT(乾燥物)に,分子生物学グレードの滅菌済み10 mM Tris(pH8.3)を加えて終濃度5 units/μlとする。1~2分間ボルテックスし,室温で15分間撹拌し,完全に溶解する。

■Two-Step RT-PCR

  1. プライマー,RNA鋳型以外の各試薬を加え,混合する。その後,プライマーとRNA鋳型を添加する。
    この際,必要があればプライマーとRNA鋳型のみをあらかじめRTバッファーに添加し,アニーリング温度でインキュベートした後に他の試薬と混合することも可能です。
  2. 50℃以上(または45℃で30~60分)でインキュベートして,cDNAの合成を行う。次に,95℃で2分間インキュベートし,逆転写酵素を失活させる。
  3. 合成したcDNAを4~10倍希釈し,通常の条件でPCRを実施する。

■One-Step RT-PCR

  1. プライマー,RNA鋳型以外の各試薬を加え,混合する。その後,プライマーとRNA鋳型を添加する。
    RT-PCR kitの逆転写酵素の濃度が未知の場合には,必要に応じてThermaStop-RTの濃度範囲を広めて(例えば0.5~4 units)最適混合比を検討して下さい。
  2. 50℃以上(または45℃で30~60分)でインキュベートして,cDNAの合成を行う。次に,95℃で2分間インキュベートし,逆転写酵素を失活させる。
  3. 適切な条件でPCRを行う。

目次に戻る

価格表

[在庫・価格 :2022年05月18日 23時09分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
ThermaStop-RT
2~3週間 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2019年12月1日号 p.21

製品記事 次世代シークエンス(NGS)関連製品特集
関連記事
ThermaStop-RT
2~3週間 ※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。 0
説明文
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ

製品記事 次世代シークエンス(NGS)関連製品特集
関連記事

[在庫・価格 :2022年05月18日 23時09分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。

ThermaStop-RT

文献数:0

説明文
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2019年12月1日号 p.21

製品記事 次世代シークエンス(NGS)関連製品特集
関連記事

ThermaStop-RT

文献数:0

説明文
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ

製品記事 次世代シークエンス(NGS)関連製品特集
関連記事

目次に戻る

お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

製品情報は掲載時点のものですが、価格表内の価格については随時最新のものに更新されます。お問い合わせいただくタイミングにより製品情報・価格などは変更されている場合があります。
表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。