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ミスプライミングを防ぐホットスタートPCR添加剤! ThermaStop / ThermaGo

掲載日情報:2018/10/12 現在Webページ番号:67633

ThermaStopThermaGoは,ホットスタートPCRにおいて問題となるエラーを最小化するために開発された画期的な添加剤です。

  • ThermaStop: 非ホットスタートタイプを含めたすべてのTaq DNAポリメラーゼに適合し,従来のホットスタート用抗体とは異なりPCR前後のミスプライミングの発生を防止する可逆性ホットスタート試薬です。
  • ThermaGo: PCRのアニーリングと伸長ステップにおけるミスプライミングを抑制し,Taq DNAポリメラーゼの特異性を向上します。

ThermaStopThermaGoの併用により,さらに特異性と再現性に優れたPCRの結果が得られます。

PCR産物の比較   Antibody based hot-starts are “leaky”, ThermaStop is Not
Representative result for four antibody based hot-start Type A Taq polymerases from four manufactures. Each enzyme was added to a master mix in its own buffer on ice and was then split into two aliquots. One aliquot received buffer and one aliquot received ThermaStop. All reactions then received a pair of overlapping primers that could only generate a product if primer-dimers formed prior to heating and amplification. The results show that antibody alone did not prevent primer-dimer formation and amplification for any enzyme. In contrast, addition of ThermaStop prevented primer-dimer formation in every case. Conclusion: antibody based hot-starts are leaky; ThermaStop is a robust universal hot-start that can be used alone or in combination with antibody.

ThermaStopにより,従来のホットスタート用抗体とは異なりPCR前後のPrimer Dimerの発生を防止した。

MEMO

一般のホットスタートPCR法のプロセスと問題点


PCRの過程

PCRではミスプライミングやプライマーダイマーによって増幅物の収率低下・非特異産物の増加等の問題が発生することが知られており,この問題はポリメラーゼの意図しない活性が原因の一つだと考えられています。現在では,意図しないポリメラーゼ活性を抑えるホットスタート技術が開発され,ホットスタートPCRとして広く利用されています。ホットスタートPCRは主にポリメラーゼの活性を抑える中和抗体を用いており,室温から60℃程度の温度域でポリメラーゼ活性を抑制し,PCR最初の変性ステップで不活性化されます。

しかし,中和抗体を用いてもPCR前のマスターミックス調製時におけるミスプライミングやプライマーダイマーの形成を完全に防止することは難しく,時間の経過とともに不適切な反応が進行する場合があります。

さらに,中和抗体はPCRの最初のサイクルで失活するため,PCR終了時の冷却ステップおいてポリメラーゼの非特異的反応を抑制できません。これにより,鋳型DNA同士の反応による目的外PCR産物の産生,混入などの問題が生じることが示唆されています。



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ThermaStopの特長

ThermaStopは,すべてのTaq DNAポリメラーゼに適合する可逆性のホットスタート試薬です。50℃以下では,ポリメラーゼに直接作用し非特異的な酵素活性を防ぎ,60℃に温度を上げるとポリメラーゼ活性が完全に回復します。

ThermaStopの特長

通常の中和抗体を用いたホットスタート型DNAポリメラーゼでは,マスターミックスの調製時の温度においても,時間の経過とともにポリメラーゼによる非特異的産物の産生が確認されます(下図参照)。また,ホットスタート用の抗体は,最初のサイクルにおいて不可逆的に不活性化されますが,ThermaStopを用いた場合では,冷却により酵素活性が再び抑制されます。この特性によって,ホットスタートPCRにおけるTaq DNAポリメラーゼの特異性およびPCR産物の収率を大幅に向上することができます。

  • 様々なTaqDNAポリメラーゼに適合します。試験済みのポリメラーゼについてはFAQのQ2をご覧下さい。
  • PCR反応前のマスターミックスに懸濁するだけで効果を発揮します。プレインキュベーションは不要です。
  • Taq DNAポリメラーゼ1Unitに対して,ThermaStop 1Unitの使用を推奨しています。非特異産物の量に応じてThermaStopの量を増やすことも可能です。
  • マルチプレックスPCRや,qPCRでも使用できます。

One-StepまたはTwo-Step RT-PCR用の逆転写酵素には,ThermaStop-RTを使用して下さい。

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ThermaStop技術について

ThermaStop技術について (クリックで開閉します)
ThermaStopと中和抗体

融解曲線解析を用いた中和抗体無し(上段),中和抗体有り(中段),ThermaStop添加(下段)それぞれにおけるPCR開始前の非特異産物産生の比較
鋳型DNAの入ったPCR用マスターミックスをすぐにPCRを開始した試料と36時間25℃でインキュベーションした試料を比較した。中和抗体が入った試料でも,36時間経過後には非特異産物の産生が確認されたが,ThermaStopは長時間安定した効果を発揮することがわかる。

PCR産物の比較

融解曲線解析におけるThermaStopとホットスタート用抗体を用いたPCRの一旦停止・冷却後のサーマルサイクリング再開におけるPCR産物の比較
ThermaStopを用いた際に,PCR反応を終了後の冷却フェーズにおける非特異産物が抑制されるため,PCRを一旦停止後に再開し,サイクル数を追加できる(図上部)。ホットスタート用抗体を用いた場合では,初回のサイクルにおいて抗体が失活するため,PCRを一旦停止し,冷却後に再開してサイクル数を追加すると,非特異的な産物が確認された(図下部)。

PCR産物の比較

低コピー数の鋳型DNAを用いたホットスタートPCRにおける抗体とThermaStopの比較
約20コピー数の鋳型DNAを含むマスターミックスにホットスタート用抗体またはThermaStopを添加し,リアルタイムPCRを行った。ThermaStopを用いた場合,Ct値のサイクル数の時点で,増幅曲線のばらつきが少なく,特異的な増幅が行われていることがわかる。


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ThermaStopの使用例

ThermaStopの使用例 (クリックで開閉します)
ThermaStopの使用例   ThermaStop Increases Enzyme Specificity Increases Reaction Sensitivity and Quantitative Accuracy
In the absence of ThermaStop and antibody Taq polymerase generated primer-dimers in the no-template-controls (NTC). Addition of 600 pg (100 genomes) of human DNA resulted in amplification of the correct product, but primer-dimer was still formed. Addition of 60 pg (10 genomes) of human DNA resulted in amplification of a small amount of the correct product, but even more primer-dimer. In contrast, in the presence of ThermaStop (no antibody) no primer-dimer formation occurred in either NTCs or plus DNA samples. Importantly, because ThermaStop increased enzyme specificity the yield of correct product went up significantly.
 
ThermaStopの使用例   ThermaStop Makes Multiplexing Easy and Reliable
A 10-plex reaction was constructed using six pairs of primers for targets in Lambda Phage genome and 4 pairs of primers for targets in the mouse genome. The primer pairs were not optimized for their compatibility with each other or to avoid primer-dimer formation. In the absence of hot-start antibody or ThermaStop a massive set of overlapping primer-dimers was amplified in the No Template Control reactions (NTC). This is because there are at least 400 ways in which 20 primers can interact and extend prior to first heating. In contrast, in the presence ThermaStop very little primer-dimer formation occurred in the NTC’s. In the 10 plex reactions 500 genomes of both Lambda DNA and mouse DNA added. In the absence of ThermaStop no correct products were made and massive amount of primer-dimer was present once again. In contrast, in the presence of ThermaStop all 10 correct products were amplified in equal amounts. Almost no primer-dimer was formed. (M is for molecular weight markers and confirms the correct products range in size from 139~962 base pairs.
 
ThermaStopの使用例   ThermaStop Greatly Enhances PCR Ready-Mixes
A set of 12 PCR ready-mixes was purchased and tested for its capacity to amplify the 10-plex described in the previous figure. The 5 best ready-mixes are shown here without (No TS) and with (TS) added ThermaStop (No TS). In every case addition of ThermaStop significantly improved the amplification of all 10 of the correct products. Ready-mixes B and F have the highest levels of correct products and lowest levels of incorrect products.

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ThermaGoの特長

ThermaGoは化学修飾した二本鎖核酸で,PCRのアニーリングと伸長ステップにおけるミスプライミングを抑制し,Taq DNAポリメラーゼの特異性を向上させます。

ThermaGoの特長
  • 低コピー数のターゲット遺伝子を増幅する際の非特異産物の産生を抑えます。
  • 次世代シークエンス用前の意図しないミスプライミングやキメラを抑制します。
  • ThermaGoをPCR反応前のマスターミックスに懸濁するだけで効果を発揮します。プレインキュベーションは不要です。
  • Taq DNAポリメラーゼ1 Unitに対して,ThermaGo 1 Unitの使用を推奨しています。

目的に応じてUnit数を調整することは可能ですが,高濃度のThermaGoは増幅を阻害する可能性があります。

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ThermaGo技術について


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製品の種類

品名または商品コードをクリックすると価格表をご覧いただけます。

品名 ThermaStop ThermaGo
商品コード TS-500 TS-2500 TG-500 TG-2500
包装 500 units*1 2,500 units*1 500 units*2 2,500 units*2
特長 ・非ホットスタートタイプを含めたすべてのTaq DNAポリメラーゼに適合する可逆性のホットスタートPCR用試薬です。
・マスターミックス調製時や,PCRの終了・冷却後におけるプライマーダイマーの生成やミスプライミングを防止します。
・PCRを一旦停止,冷却後に,再度サーマルサイクリングを行うことができます。
・化学修飾した二本鎖核酸です。
・PCR反応の再現性を向上させます。
・非特異的な産物を抑制するため,低コピー数の標的をより多く検出できるようになります。
・標準PCRおよびデジタルPCRにおけるシグナルのばらつきを低減します。
・次世代シークエンシング前のミスプライミングやキメラの生成を減少します。
・エンドポイント遺伝子型判定に有用です。

*1 ThermaStopの単位(unit数)の定義
ThermaStop 1 unitは,25μl中にTaq DNAポリメラーゼ1 unitを含む増幅反応において,最大ホットスタート活性を得るための必要量です。

*2 ThermaGoの単位(unit数)の定義
ThermaGo 1 unitは,25μl中にTaq DNAポリメラーゼ1 unitを含む増幅反応において,最大の特異性,収率および再現性を得るための必要量です。

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FAQ

FAQ (クリックで開閉します)

■ThermaStop

Q-1. ThermaStopを使用する際の再懸濁はどうすればよいですか?
A-1. 5 units/μlのThermaStopを調製するには,ThermaStop(乾燥試薬)500 unitsに分子生物学グレードの100μlの10 mM Tris-Cl(pH 8.3)(ThermaStop(乾燥試薬)2,500 unitsに500μlの10 mM Tris-Cl(pH 8.3))を加え,1~2分間ボルテックス後,遠心分離を短時間行って下さい。その後,時折混合しながらチューブを室温で15分間放置し,試薬を完全に溶解させて下さい。

Q-2. ThermaStopは,どのようなポリメラーゼ酵素と適合しますか?
A-2. ThermaStopは,すべての天然および組換えTaq DNAポリメラーゼ,熱活性Taq DNAポリメラーゼおよびTfi DNAポリメラーゼなどの多くのDNA依存性DNAポリメラーゼと適合します。ThermaStopは,以下の市販酵素で試験済みです。

非ホットスタートタイプポリメラーゼ酵素
a)Invitrogen(現Thermo Fisher Scientific)社:組換えTaq DNAポリメラーゼ
b)Promega社:GoTaq DNAポリメラーゼ

ホットスタートタイプポリメラーゼ酵素
a)Invitrogen(現Thermo Fisher Scientific)社:Platinum Taq DNAポリメラーゼ
b)Promega社:GoTaq DNAポリメラーゼ
c)Applied Biosystems(現Thermo Fisher Scientific)社:AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ

Q-3. ThermaStopをマスターミックスに直接追加することはできますか?
A-3. はい。ThermaStopとDNAポリメラーゼとをプレインキュベートする必要はありません。プライマーと鋳型DNAターゲットを追加する前に,ThermaStopをマスターミックスに添加して下さい。

Q-4. ThermaStopを加えてから反応開始まで,どれくらいの時間を置くことができますか?
A-4. ThermaStopをPCRマスターミックスに添加した後,すぐに反応を開始できます。また,ThermaStopを加えたPCRマスターミックスは,必要に応じてPCRを開始するまで室温で最大24時間保存することができます。

Q-5. 現在使用中のTaqポリメラーゼに対してThermaStopをどのくらい使用しますか?
A-5. 同じunit数のThermaStopおよびTaq DNAポリメラーゼをマスターミックスに加えます。非特異的産物を多量に産生する反応においては,Taq DNAポリメラーゼ1 unitあたりThermaStop 1.5~4 unitsを加えて下さい。

Q-6. RT-PCRでThermaStopを使用できますか?
A-6. いいえ,すべてのRT-PCRにおいて,ThermaStop-RTの使用をお推めします。

Q-7. マルチプレックスPCRでThermaStopを使用できますか?
A-7. はい。ThermaStopに加えて,Taq DNAポリメラーゼの特異性を高め,PCRのアニーリングおよび伸長ステップにおけるミスプライミングを抑制するThermaGoの併用をお勧めします。

Q-8. ThermaStopの使用によりどのような改善が見られますか?
A-8. ThermaStopは,非ホットスタートの場合と比較して,プライマーダイマーや非特異的産物の産生を減少させ,正しい産物(例えば,プローブシグナル増加やゲル上の正しいバンド)を高収量で産生します。

■ThermaGo

Q-9. ThermaGoを使用する際の再懸濁はどうすればよいですか?
A-9. 5 units/μlのThermaGoを調製するには,ThermaGo(乾燥試薬)500 unitsに分子生物学グレードの100μlの10 mM Tris-Cl(pH 8.3)(ThermaGo(乾燥試薬)2,500 unitsに500μlの10 mM Tris-Cl(pH 8.3))を加え,1~2分間ボルテックス後,遠心分離を短時間行って下さい。時折混合しながらチューブを室温で15分間放置し,試薬を完全に溶解させて下さい。

Q-10. ThermaGoは,どのようなポリメラーゼ酵素と適合しますか?
A-10. ThermaGoはすべてのTaq DNAポリメラーゼと互換性があります。

Q-11. ThermaGoをマスターミックスに直接追加することはできますか?
A-11. はい。ThermaGoとTaq DNAポリメラーゼとをプレインキュベートする必要はありません。

Q-12. ThermaGoを加えてから反応開始まで,どれくらいの時間を置くことができますか?
A-12. ThermaGoをマスターミックスに添加すると,すぐに反応を開始できます。

Q-13. 現在使用中のTaqポリメラーゼでThermaGoを何unit使用しますか?
A-13. まず,同じunit数のThermaGoおよびTaq DNAポリメラーゼをマスターミックスに加えて下さい。さらに最適化するために,Taq DNAポリメラーゼ単位あたりThermaGo 0.5~≧2.0 unitsの範囲で試験します。
※補注:非常に高レベルのThermaGoは増幅を阻害する可能性があります。

Q-14. マルチプレックスPCRでThermaGoを使用できますか?
A-14. はい。ThermaGoに加えて,ThermaStopの併用をお勧めします。ThermaStopはポリメラーゼに直接作用し,50℃以下の非特異的酵素活性を抑制します。ポリメラーゼ活性は60℃で完全に回復しますが,冷却後にThermaStopにより再び反応が抑制されます。

Q-15. ThermaGoの使用によりどのような改善が見られますか?
A-15. 最適レベルのThermaGoを含むPCRにおいて,非特異的産物の生成を抑制し,定量的な再現性を向上させます。また,ThermaGoの使用により,より高収率の目的産物(例えば,より強いプローブシグナルやゲル上の正しいバンド)を得ることができます。

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価格表

[在庫・価格 :2019年12月13日 12時51分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
ThermaStop
- 0
説明文
PCRの非特異産物を減らす添加剤です。従来のマスターミックス調製時に加えるだけでポリメラーゼの酵素活性を防ぎ,50℃を超えるとポリメラーゼ活性を回復させます。従来のTaq抗体と異なり、PCR反応終了後もポリメラーゼの活性を抑えます。
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2018年4月1日号 p.5

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ThermaStop
2週間程度  0
説明文
PCRの非特異産物を減らす添加剤です。従来のマスターミックス調製時に加えるだけでポリメラーゼの酵素活性を防ぎ,50℃を超えるとポリメラーゼ活性を回復させます。従来のTaq抗体と異なり、PCR反応終了後もポリメラーゼの活性を抑えます。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ

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ThermaGo
- 0
説明文
PCRの非特異産物を減らす添加剤です。2本鎖の化学修飾された核酸で,PCRのアニーリングおよび伸長反応の際のミスプライミングを防ぎます。PCR反応前のマスターミックスに添加するだけで効果を発揮します。
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2018年4月1日号 p.5

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ThermaGo
2週間程度  0
説明文
PCRの非特異産物を減らす添加剤です。2本鎖の化学修飾された核酸で,PCRのアニーリングおよび伸長反応の際のミスプライミングを防ぎます。PCR反応前のマスターミックスに添加するだけで効果を発揮します。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ ニュース2018年4月1日号 p.5
ニュース2018年3月15日号 p.23

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[在庫・価格 :2019年12月13日 12時51分現在]

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ThermaStop

文献数:0

  • 商品コード:TS-500
  • メーカー:TGX
  • 包装:500units
  • 価格:¥30,000
  • 在庫:1個
  • 納期:-
  • 法規制等:

説明文 PCRの非特異産物を減らす添加剤です。従来のマスターミックス調製時に加えるだけでポリメラーゼの酵素活性を防ぎ,50℃を超えるとポリメラーゼ活性を回復させます。従来のTaq抗体と異なり、PCR反応終了後もポリメラーゼの活性を抑えます。
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2018年4月1日号 p.5

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ThermaStop

文献数:0

  • 商品コード:TS-2500
  • メーカー:TGX
  • 包装:2500units
  • 価格:¥130,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:

説明文 PCRの非特異産物を減らす添加剤です。従来のマスターミックス調製時に加えるだけでポリメラーゼの酵素活性を防ぎ,50℃を超えるとポリメラーゼ活性を回復させます。従来のTaq抗体と異なり、PCR反応終了後もポリメラーゼの活性を抑えます。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ

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ThermaGo

文献数:0

  • 商品コード:TG-500
  • メーカー:TGX
  • 包装:500units
  • 価格:¥20,000
  • 在庫:2個
  • 納期:-
  • 法規制等:

説明文 PCRの非特異産物を減らす添加剤です。2本鎖の化学修飾された核酸で,PCRのアニーリングおよび伸長反応の際のミスプライミングを防ぎます。PCR反応前のマスターミックスに添加するだけで効果を発揮します。
法規制等
保存条件 4℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2018年4月1日号 p.5

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ThermaGo

文献数:0

  • 商品コード:TG-2500
  • メーカー:TGX
  • 包装:2500units
  • 価格:¥90,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:

説明文 PCRの非特異産物を減らす添加剤です。2本鎖の化学修飾された核酸で,PCRのアニーリングおよび伸長反応の際のミスプライミングを防ぎます。PCR反応前のマスターミックスに添加するだけで効果を発揮します。
法規制等
保存条件 室温 法規備考
掲載カタログ ニュース2018年4月1日号 p.5
ニュース2018年3月15日号 p.23

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

製品情報は掲載時点のものですが、価格表内の価格については随時最新のものに更新されます。お問い合わせいただくタイミングにより製品情報・価格などは変更されている場合があります。
表示価格に、消費税等は含まれていません。一部価格が予告なく変更される場合がありますので、あらかじめご了承下さい。