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初代細胞と幹細胞のCRISPR/Cas9ゲノム編集にお勧めな化学修飾sgRNA CRISPRevolution Chemically Modified sgRNA合成受託サービス

掲載日情報:2019/08/23 現在Webページ番号:67605

CRISPRevolution画像

S. pyogenes に由来するCas9(SpCas9)用の「CRISPRevolution」と呼ばれるguideRNAの化学修飾sgRNA合成受託サービスです。標的配列(17~23 nt)をご指定いただくことで,最大90%の高いゲノム編集効率を持つ一本鎖guideRNA(sgRNA)であり,更に,幹細胞および編集困難な細胞の編集用の化学修飾sgRNAです。

「CRISPRevolution sgRNA合成受託サービス」の詳細については,こちらをご覧下さい。

各社核酸合成関連受託サービスバナー guide RNAによるゲノム編集ツール CRISPR-Cas9特集

ゲノム編集が困難な初代細胞や幹細胞などに

  • Chemically Modified sgRNA を用いれば,初代細胞や幹細胞,K562 細胞やがん細胞株,造血幹細胞由来細胞といったゲノム編集が 難しい細胞にも高効率に安定した塩基の挿入/欠損(Indel formation)を起こすことができます。
  • Synthego 社のsgRNA は完全合成されているため,IVT で作製したsgRNA とは違い100% DNA-free です。これにより,高い効率でノックアウト/ノックイン動物モデルの作製が可能となりました。
  • 同一のguideRNA 配列であっても,Synthego 社sgRNAではエクソン切断効率が2 倍異なることが報告されています。また,ノックイン効率もIVT に比べ3 倍も上昇しました。
Chemically Modified sgRNAのエクソン切断効率

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特長

  • 初代細胞と幹細胞で最大90%の高いゲノム編集効率を示します。
  • 修飾sgRNAを持つ細胞は高い生存率を示します。
  • 低コストかつ短時間でChemically Modified sgRNAを納品できます。
  • 植物と原核細胞の編集を向上させます。
  • SpCas9向けに最適化されています。
  • sgRNAを作製する際の手間がかかるアニーリング操作が不要です。
  • 100% Nucleaseフリーです。
  • シングルオリゴヌクレオチド(完全長100-mer)です。
  • 容量:3 nmol(OD260)
    トランスフェクション10~20回分

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Chemically Modified sgRNAの構造

ガイドRNA の5’ と3’ 末端RNA 残基に2’-O-methyl analogsと3’phospho-rothioate inter-nucleotide を結合しており,細胞内でのRNA 分解を抑制しています。

Chemically Modified sgRNAの構造

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Synthego社の合成RNA(sgRNA)とプラスミドおよびIVTの比較

Synthego社の合成RNA(sgRNA)とプラスミドおよびIVTの比較 (クリックで開閉します)

  Synthego(sgRNA) Plasmid in vitro Transcription (IVT)
guideRNA作製過程 1. 標的シークエンスを選択する。
2. 合成RNAを注文する。
1. 標的シークエンスを選択する。
2. DNAプライマーを準備する。
3. プラスミド内へguideRNAをPCRする。
4. 細胞内へトランスフェクトする。
5. 細胞をスクリーニングする。
6. シークエンスを検証する。
7. プラスミドDNAを精製する。
1. 標的シークエンスを選択する。
2. DNAプライマーを準備する。
3. PCRでguideRNAを作製する。
4. IVTを行う。
5. guideRNAを精製する。
製品購入後の
トランスフェクション
開始時間
購入後すぐ 1~2週間 1~3日
作業時間 数分 数日 1日
編集効率 最大90% 中~高 様々
品質 非常に高い 様々 低い(不純物があり,不一致もみられる)
初代細胞および幹細胞への効率 非常に良い 悪い 悪い
オフターゲット効果 非常に低い 様々(宿主ゲノム内へのDNA混入の可能性あり) 様々(IVT用酵素がエラーを引き起こす可能性あり)

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化学修飾sgRNAの比較例

CD34+ 幹細胞における編集効率の比較

CD34+ 幹細胞における編集効率の比較(スタンフォード大学)
CD3タンパクの発現抑制を目的として,TCRα遺伝子をターゲットとしたguideRNAとCas9タンパクをCD34+ヒト造血幹細胞にエレクトロポレーションで導入した。トランスフェクションを行ってから7日後にノックアウト効率をFACSで測定した。

CD34+CD38- 原始幹細胞の生存率および編集効率の比較

CD34+CD38- 原始幹細胞の生存率および編集効率の比較
ヒト臍帯血CD34+ SPCをSynthego社合成化学修飾sgRNAを用いて編集し,照射超免疫不全マウス(NOD scid gamma mouse)に移植した。移植12週間後,末梢血と骨髄のin vivo 編集効率をFACSで評価した。

修飾幹細胞の移植12週間後,8匹の異種移植マウスの骨髄細胞において平均90%の編集効率が認められた。これらのうち,細胞表面レセプターノックアウトが,CD34+(データ無し)とCD34+CD38-の集団の両方で認められたことから,遺伝学的修飾を受けたhSPCの成功を示している。
表中のドット:各々のコンディションにおけるマウス(n=8)

末梢血における分化移植幹細胞の比較

末梢血における分化移植幹細胞の比較
異種移植マウスの末梢血から分離された総細胞の80~90%が,移植12週間後,移植された遺伝学的修飾ヒト幹細胞から産生された。遺伝学的修飾CD34++hSPCsが骨髄へ移植され,CD19+(B細胞)とCD33+骨髄始原細胞へ分化した。幹細胞の複製集団は化学修飾合成sgRNAで効率的に編集されたことを示している。
表中のドット:各々のコンディションにおけるマウス(n=8)

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CRISPR Guide RNAデザインツール

100,000種以上のゲノムと9,000の生物種から選択し,オフターゲット効果が最小限になると期待される遺伝子ノックアウト用CRISPR guideを簡単にデザインできます。下記デザイン画像をクリックして下さい。

CRISPR Guide RNAデザインツール

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Synthego社の合成RNA(sgRNA)のキット内容

  • CRISPRevolution Chemically modified synthetic guide RNA 3 nmol
  • TE buffer 1.5 ml
  • Nuclease-free water 1.5 ml

オプション品(単品購入不可,詳細はお問い合わせ下さい)

  • Cas9 Protein 300 pmol, 1,000 pmol
  • Annealing buffer 1.5 ml
  • Tris-EDTA buffer 1.5 ml
  • Nuclease-free water 1.5 ml
  • Transfection Optimization Kit(Multi-guide)
  • CRISPRevolution Controls Kit, Human
  • Positive Control sgRNA(modified), Human RELA (1 nmol)
  • Positive Control sgRNA(modified), Human CDC42BPB (1 nmol)
  • Negative Control sgRNA(modified) #1 (1 nmol)
  • Negative Control sgRNA(modified) #2 (1 nmol)

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ご注文方法/価格

標的配列(17~23 mer)をご指定下さい。
例.5′-AAUUUCACAGCUGCACAUA+Synthego Scaffold-3′

専用注文書に必要事項をご記入の上,電子メールに添付して当社受託・特注品業務担当(e-mail:jutaku@funakoshi.co.jp)までお送り下さい。

[在庫・価格 :2021年09月25日 00時14分現在]

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Modified sgRNA Kit, 1.5nmol
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Modified sgRNA Kit, 50nmol
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Modified sgRNA Kit, 100nmol
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オプション品の価格

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Cas9 2NLS Nuclease
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Tris-EDTA Buffer
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Nuclease-free Water
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Positive Control sgRNA, Human RELA
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Positive Control sgRNA, Human CDC42BPB
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Negative Control sgRNA #1
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Negative Control sgRNA #2
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Cas9 2NLS Nuclease

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Positive Control sgRNA, Human CDC42BPB

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Negative Control sgRNA #1

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Negative Control sgRNA #2

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