細胞内のERK/AMPK/NFκBリン酸化状態スクリーニング受託サービス（BioAssay Systems社） Phosphorylation Status Screening Service

BioAssay Systems社では細胞のシグナル伝達に関与する、細胞内のERKリン酸化状態を増加または減少させるモジュレーター候補物質のスクリーニングする受託サービスを提供しています。特定の細胞に被験物質のリガンドまたは薬物を処理した後に、ERK/AMPK/NFκBのリン酸化動態、EC₅₀、IC₅₀をBioAssay Systems社のEnzyFluoリン酸化タンパク質測定キットを使用して測定します。測定は、さまざまな細胞株で実行できます。

※ 測定に使用するアッセイキットについては、「EnzyFluoリン酸化タンパク質測定キットシリーズ」をご覧下さい。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

※ その他のタンパク質のリン酸化状態スクリーニングについても、当社受託・特注品担当（下記参照）までお問い合わせ下さい。

ERKリン酸化の経時変化を決定するために、ホルボールミリスチン酸アセテート（PMA）の濃度について滴定を行った。黒色96ウェルプレートに、PANC-1細胞を10,000 cells/wellの細胞密度でプレーティングし、一晩接着させた。翌日、培養液を除去し、各濃度10²、10¹、10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、および0μg/ml）のPMAを添加した培地（DMSO最終濃度1％）と交換した。PMAとともに30分間インキュベートした後、ERK Phosphorylation Assay Kit （#EERK-100）を用いてpERKおよび総タンパク質を定量した。pERKの値は、試料の総タンパク質量で正規化した。

PMAの濃度の滴定後、特定の投与量（濃度100 ng/ml）のPMAに対するERKリン酸化動態を測定した。黒色96ウェルプレートに、PANC-1細胞を10,000 cells/wellの細胞密度でプレーティングし、一晩接着させた。翌日、培養液を除去した後に100 ng/mlのPMAを添加した新しい培地（DMSO最終濃度1％）に交換し、2.5、5、10、20、30分間インキュベートした。それぞれの時間において、ERK Phosphorylation Assay Kit （#EERK-100）を用いて、pERKおよび総タンパク質を定量した。pERKの値は、試料の総タンパク質量で正規化した。

ERKリン酸化の阻害物質であるSorafenibのIC₅₀を3つの細胞株（PANC-1、NIH-3T3、RBL-2H3）について測定した。各細胞株を黒色96ウェルプレートに10,000 cells/wellの細胞密度でプレーティングし、一晩接着させた。培養液を吸引し、各濃度（10^-2、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、および10^-9 M）のSorafenibを添加した新しい培地（DMSO最終濃度1％）と交換した。ネゲティブコントロールのウェルには、Sorafenib無添加培地（DMSO最終濃度1％）を添加した。各細胞をSorafenibとともに3時間インキュベートした後、100 ng/mlのPMAを添加した新しい培地と交換し5分間インキュベートした。その後、ERK Phosphorylation Assay Kit （#EERK-100）を用いて、pERKおよび総タンパク質を定量した。pERKの値は、試料の総タンパク質量で正規化した。IC₅₀値はGraphpad Prismを用いて算出した。SorafenibのIC₅₀値は、それぞれの細胞株に対するIC50は、2.1μM（RBL-2H3）、11.4μM（NIH-3T3）、および11.5μM（PANC-1）と算出された。

詳細は当社受託・特注品担当（下記参照）までお問い合わせ下さい。