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植物葉組織からルビスコを除去して総タンパク質を抽出するキット Minute Rubisco Depletion Kit

掲載日情報:2020/06/19 現在Webページ番号:65917

植物の葉タンパク質の40~80%を占めるRubisco(ルビスコ)を除去し,総タンパク質を抽出できるキットです。
Rubisco以外の,葉に少量しか含まれないタンパク質を解析する際に有用です。

特長

  • ルビスコ除去バッファーと専用フィルターカートリッジを使用することにより,1時間以内にルビスコ除去ができるキットです。
  • ほとんどの葉組織で,100〜200 µgのタンパク質が得られます(TCA沈殿後の最終的な収量)。
  • 可溶化ミクロソーム画分と水溶性画分を別々に抽出し,最後に混合することで,ルビスコ除去済み全タンパク質を抽出します。
  • 得られた総タンパク質はSDS-PAGE,2DE,LC-MS/MS分析など,様々な下流アプリケーションに使用できます(別途TCA沈殿が必要です)。
  • ルビスコの除去やTCA沈殿を行わずに水溶性タンパク質画分のみを回収し,免疫沈降などのアプリケーションに直接使用することもできます。
  • 20回分

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従来のRubisco除去方法について

ルビスコ(Rubisco, Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase)は光合成で働く酵素であり,植物に豊富に含まれています。多量のルビスコは,植物のプロテオーム解析をする際のボトルネックとなります。LC-MS/MSベースの解析では,ルビスコの存在がその他のタンパク質をマスクしてしまい,存在量の少ないタンパク質の検出と同定が困難となります。抽出された全タンパク質からルビスコを除去するために,特異的なIgY抗体をコンジュゲートしたレジンが市販されていますが,これは一度に少量のタンパク質しか処理できず,非常にコストがかかります。文献に記載されたその他の方法も存在しますが,どれも面倒で時間がかかります。
本製品は,従来の問題点を解決し,簡便かつ短時間でタンパク質の脱ルビスコ処理ができるキットです。


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操作方法概略

    1. 150〜200 mgの新鮮または冷凍の葉を,フィルターカラムをセットしたコレクションチューブに入れる。100µlのBuffer Aと80 mgのprotein extraction powderを加える。
      あらかじめBuffer Aにプロテナーゼインヒビターを添加しておくことをお勧めします。
    2. ペッスルで葉をすりつぶす。
    3. さらに200µlのBuffer Aを加え,葉を200µlのピペットチップで数回かき混ぜる。16,000×gで1分間遠心し,フィルターカラムを捨てる。ペレットをピペッティングにより再懸濁し,新しい1.5 mlマイクロチューブに移す。
    4. 新たに80~100 mgのProtein extraction powderをチューブに加え,ペレットをペッスルで粉砕する。300×gで2分間遠心し,200µlの上清を新しい1.5 mlマイクロチューブに移す。
    5. 16,000×gで30分間遠心し,すべての上清を新しい1.5 mlマイクロチューブに移す。チューブはオンアイスにしておく(⇒水溶性タンパク質画分)
    6. 200µlのBuffer Aをステップ5のペレット(⇒ミクロソーム画分)にゆっくりと加え,ペレットの形を乱さないようにバッファーをすぐに取り除く。
      上記は残留した細胞質タンパク質を洗い流すステップです。
      ペレットを200µlのバッファーAで再懸濁し,ピペッティングしてから20µlのBuffer Cを加える。よく混合し,室温で5分間インキュベートする。16,000×gで5分間遠心する。上清を新しい1.5 mlマイクロチューブに移す(⇒水溶性ミクロソーム画分)。チューブはオンアイスにしておく。
    7. ステップ5で得た200µlの水溶性タンパク質画分に200µlのBuffer Bを加える。短時間ボルテックスし,氷上で10分間インキュベートする。10,000×gで5分間遠心する。このペレットには除去されたルビスコが含まれる。 400µlの上清を,上記のステップ6で可溶化したミクロソーム画分200µlに加え,混合する。
      ⇒ルビスコ除去済みの総タンパク質画分,600µlが得られる。

得られた総タンパク質抽出物には高濃度の塩と界面活性剤が含まれているため,SDS-PAGE,2Dゲル分析,MS分光分析などの下流アプリケーションの前にTCA沈殿で除去する必要があります。 Invent Biotechnologies社の高効率タンパク質沈殿キット(#WA-006)の使用をお勧めします。文献で公開されているTCA法も使用できます。
■参考文献:Niu L. et al. (2018) Modified TCA/acetone precipitation of plant proteins for proteomic analysis. PLoS ONE 13(12): e0202238.

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使用例

Rubisco Depletion Kit

本製品でルビスコを除去した総タンパク質試料についてSDS-PAGEを行った。
試料A:ナタネ葉(新鮮葉), B:エンドウ葉(レーン7のみ凍結試料),C:シロイヌナズナ葉(新鮮葉)
レーン1,4,8:ルビスコ除去なし
レーン2,3,5,6,7,9:ルビスコ除去後

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キット内容

Rubisco Depletion Kit
  • Buffer A
  • Buffer B
  • Buffer C
  • 1.5 mlマイクロチューブ用ペッスル(20個)
  • フィルターカラムカートリッジとコレクションチューブ(各20個)
  • Protein extraction powder

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価格

[在庫・価格 :2022年05月17日 12時51分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
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納期 文献数
Minute Rubisco Depletion Kit (20 tests)
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法規制等
保存条件 4℃ 法規備考
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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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