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生細胞におけるオートファジー検出キット Autophagy Assay, Red

掲載日情報：2020/01/22 現在Webページ番号：65488

イムノケミストリーテクノロジーズ /
Immunochemistry Technologies, LLC
[メーカー略称：ITL]

赤色蛍光プローブを用いて、生細胞におけるオートファジーをin vitro で検出およびモニターするキットです。プローブは細胞透過性で、オートファゴソームまたはオートリソソームの脂質膜に取り込まれて発する赤色蛍光をフローサイトメーターにより検出します。

※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

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使用例

オートファジー誘導の測定

Rapamycin、Chloroquine 18時間処理によるJurkat細胞のオートファジー誘導の測定

蛍光シグナル中央値、陽／陰性細胞の比率（％）

オートファジー誘導の測定


  • 黒線：未処理(DMSO)、橙線：0.5 μM Rapamycin、青線：10 μM Chloroquine、赤線：0.5 μM Rapamycinおよび10μM Chloroquine
  • ※Dr. Kristi Strandberg （ICT 228:37-40）提供

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オートファジー（Autophagy）とは

オートファジーは保存されたリソソームのリサイクルプロセスであり、細胞が自身のタンパク質、脂質、炭水化物などの成分を分解します。オートファジーは、不必要または機能不全の細胞および細胞成分を分解することにより、損傷したオルガネラの蓄積を防止しホメオスタシスの保全において重要な役割を果たしています。通常、オートファジーは細胞内においては低頻度で起こり、飢餓またはストレスにより急速に上方調節されます。オートファジーの分解活性は、生物学的エネルギーの必要性が高い期間におけるアミノ酸、ヌクレオチド、脂肪酸などの栄養素とエネルギー供給に役立ちます。オートファジーのもう一つの機能は、細胞内病原体（ウイルス、細菌および寄生虫）の検出および破壊の補助です。オートファジーの調節不全は、がん、感染症および変性疾患などの多くの疾患状態と関連しています。

オートファジーは、通常3段階からなるダイナミックなプロセスです（下図参照）。第1段階では、分解の標的となる細胞質成分が二重膜ファゴフォア（分離膜）内に隔離され、オートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞を形成します。第2段階では、オートファゴソームはリソソームと融合してオートファゴリソソームまたはオートリソソームを形成します。第3段階で、オートファゴソーム内容物の分解が起こります。

オートファジー

オートファジーの細胞プロセス

オートファジーは、細胞質ゾルの小器官および物質が単離膜内に封入されてオートファゴソーム（autophagosome）を形成する細胞内分解プロセスです。オートファゴソームの外膜は、リソソーム（lysosome）と融合します。隔離された物質は、その後オートリソソーム（autolysosome）内で分解されます。

参考文献

  1. Mizushima, N. and Komatsu, M., "Autophagy: renovation of cells and tissues", Cell, 147(4), 728～741 (2011). [PMID：22078875]
  2. Levine, B. and Kroemer, G., "Autophagy in the pathogenesis of disease", Cell, 132(1), 27～42 (2008). [PMID：18191218]
  3. Levine, B., et al., "Autophagy in immunity and inflammation", Nature, 469(7330), 323～335 (2011). [PMID：21248839]
  4. Hundeshagen, P., A. et al., "Concurrent detection of autolysosome formation and lysosomal degradation by flow cytometry in a high-content screen for inducers of autophagy", Biol., 9, 38 (2011). [PMID：21635740]


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特長

  • キットにはホルムアルデヒド（Fixative、固定化剤）が含まれています。
  • 測定波長：励起590 nm／蛍光 620 nm
  • フローサイトメーター分析推奨条件：細胞数：3～5×105 cells/ml、試料量：0.5 ml

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キット内容

  • Autophagy probe, Red
  • Cellular assay buffer
  • Fixative
#9156製品外観

Autophagy Assay, Red（#9156）製品外観

※ 測定にはフローサイトメーターが必要です。

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操作方法概略

  1. 新鮮な細胞培養培地（PBSのような代替緩衝液も使用可）で試料およびコントロールを調製する。
  2. 100μlのDMSOでAutophagy Probe, Redを調製する。
  3. 400μlのdiH2O、PBSまたは新鮮な細胞培養培地でAutophagy Probe, Redを5倍希釈する。
  4. Autophagy Probe, Red希釈液を各サンプルに添加する（例、1：50希釈では490μlの試料にAutophagy Probe, Red希釈液を10μl添加）*1。
  5. 約1時間インキュベートする*2。
  6. 遠心分離（200×gで5～10分間）する。
  7. 遠心上清を除去し、細胞を3回洗浄する：1×cellular assay bufferまたは新鮮な細胞培養培地を加え、細胞を遠心する。
  8. 細胞ペレットを Cellular assay buffer（通常1試料当たり0.5 ml）に再懸濁する。
  9. フローサイトメーター（緑色/黄色レーザーと適切なフィルターを使用）により分析する。

*1 最適染色濃度は、細胞株や適用などにより変化します。推奨試料量は0.5 mlです。
*2 細胞株によってはインキュベーション時間の最適化が必要となります。


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赤色蛍光プローブを用いて，生細胞におけるオートファジーをin vitro で検出およびモニターするキット。プローブは細胞透過性で，オートファゴソームまたはオートリソソームの脂質膜に取り込まれて発する赤色蛍光をフローサイトメーターにより検出する。濃度細胞：3～5×105 cells/ml，試料量：0.5 ml。
法規制等 医薬用外劇物
保存条件 4℃,-20℃,暗所保存 法規備考
掲載カタログ ニュース2022年11月1日号 p.8
ニュース2017年6月1日号 p.25

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お問い合わせ先

（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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