デジタルPCR受託サービス
掲載日情報：2022/01/20 現在Webページ番号：65425
Bio-Rad QX200を用いたデジタルPCR受託サービスです。限界希釈＊した試料をマイクロ流路技術により、微小区画（water-in-oilのドロップレット）に分散させてエンドポイントPCRを行います。
※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。
＊各微小区画にターゲットDNAが1または0となるような希釈
追加しました。
特長
- ターゲット遺伝子を含むドロップレットでは増幅シグナル（ポジティブ）とターゲット遺伝子を含まないドロップレット（ネガティブ）の微小区画をカウントし、試料の濃度を測定します。
- ポジティブの数とコピー数をポワソン分布で補正することにより最終濃度を算出します。
- Bio-Rad QX200デジタルPCRシステムは、加水分解プローブと二本鎖DNAにインターカレートするEvaGreen色素のどちらでも測定することができます。
- 希少変異解析、CNV（コピー数多型 ）、低発現の遺伝子や miRNA 定量のほか、マイクロアレイ、次世代シーケンス解析などの実験系で絞り込んだ遺伝子の検証実験等にもご利用いただけます。
追加しました。
デジタルPCRの利点
- PCR増幅効率に左右されない
- 限界希釈を行うため、試料中のPCR阻害要因を軽減
- PCR阻害要因の軽減と反応が飽和するまでの増幅により感度が高い
- 検量線を使わずに定量可能
追加しました。
サービス概要
- 試料のクオリティチェック（QC）を行う（必要に応じて実験のご提案を柔軟に行います）。
- PCRマスターミックスと試料混合を調整し、専用オイルを用いてドロップレットを作成する。
RNAの場合、cDNA合成を行う。 - PCR終了後、専用のReader（QX200）にセットし、シースフローにより一つ一つのドロップレットを流路内に移動させ、ポジティブドロップレットとネガティブドロップレットの数をカウントする。
- ポアソン分布にあてはめることにより、試料の濃度を測定する。
※ プライマー ・ プローブをお持ちでない場合、プローブの検索 ・ 設計を行います。検索は PrimePCR ddPCR Assays(Bio-Rad社) 、TaqMan Assays（Thermo Fisher Scientific社）またはLBx Probe（理研ジェネシス社）となります。
追加しました。
データ解析
デジタルPCRでは試料の単位容量当たりにターゲット遺伝子が何コピー 存在するかを算出しますが、限界希釈であっても微小区画当たりの断片数が1以上になる場合があります。これを補正するため、ポジティブの数と微小区画の数をポアソン分布にあてはめて最終濃度を算出します。この補正は微小区画数が多いほど精度が高くなり、ばらつきをおさえるには1試料当たり10,000区画以上が必要とされています。
ポアソン分布は独立した事象の発生確率が一定の分布を示すことにもとづいていますが、デジタルPCRで考えるとこのようになります。
| ポアソン分布は独立した事象の発生確率が一定の分布を示すことにもとづいていますが、デジタルPCRで考えるとこのようになります。 |  （画像をクリックすると拡大図をご覧いただけます） |
| 試料中のターゲット遺伝子コピー数が多くなるほど、複数個のターゲッ トを含む微小区画も増加するので、これをポアソン分布で補正してコピー 数を算出します。 | （画像をクリックすると拡大図をご覧いただけます） |
