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網羅的RNA-seq用ライブラリー構築用逆転写酵素 TGIRT-III Reverse transcriptase

掲載日情報:2016/06/28 現在Webページ番号:64828

TGIRT(Thermostable Group II intron reverse transcriptase)は,原核生物や真菌などのレトロトランスポゾン内に存在する新しい逆転写酵素です。InGex社のTGIRT-IIIは,従来のレトロウィルス由来の逆転写酵素に比べて,熱安定性や処理性,正確性が優れています。遺伝子改変型のTGIRT-Ⅲは逆転写酵素活性に加えてRNA-seqやPCRアダプターを付加する活性(Template-switching 活性)を持っているため,別にRNA3'アダプターの結合は不要です。このTemplate-switching 活性は,ランダムプライマーやRNAリガーゼをアダプターの結合に使用する方法に対して,網羅的RNA-seqライブラリーの構築に優れています。

MEMO

TGIRT-IIIによるTemplate Switching 活性


miRNAやtRNA,snoRNAのようなポリA尾部を有していないRNAのcDNAライブラリーを構築する場合,逆転写反応の前に,共通のアダプター配列をRNAの末端に導入する必要があります(Template switching)。従来はT4 ligaseがアダプターの付加に用いられていますが,アダプター付加の段階にバイアスが生じることが問題視されています。TGIRT-III は逆転写反応の際に,RNAアダプターとDNAプライマーのハイブリッドプライマーを用いることにより,別途RNAアダプターを付加する反応を必要とせずに,cDNAの5’末端にアダプターを付加することができます。(下図参照)。

逆転写酵素TGIRT の原理

TGIRT-IIIのTemplate switching 活性のスキーム

  1. 従来用いるRNAアダプターと相補的なDNA鎖をアニールしたRNA/DNAハイブリッドにTGIRT-IIIが結合する。RNA鎖に対して,DNA鎖は3’末端が1塩基だけ突出しており,A, T, C, Gがそれぞれ25%ずつ含まれている。
  2. RNA/DNAハイブリッドプライマーの3’側の突出した1塩基がRNAの3’末端にアニーリングする。
  3. TGIRT-IIIはRNA/DNAハイブリッドプライマーのDNA鎖からcDNAを伸長するため,得られるcDNA鎖は5’末端にアダプターを有する。

dsDNAを用いると,Template switching 活性が著しく低下します。RNA/DNAハイブリッドをご使用下さい。

製品の種類と構成品

  • TGIRT-III 酵素単品
    さまざまな用途に使用可能な酵素単体です。RNAアダプターとDNAプライマーは別途ご用意下さい。
  • TGIRT Template-Switching RNA-seq Kit
    イルミナ社のR2アダプター用のキットです。イルミナ社R2 RNA/ R2R DNA ハイブリッド-TGIRT複合体,5x Reaction buffer,10x DTTを含みます。イルミナ社 R1R DNAオリゴは別途ご用意ください。

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アプリケーション例

  • 網羅的鎖特異的トランスクリプトーム解析
  • RNA-seq (細胞由来RNA,エキソソーム由来RNA,血漿中RNA,細胞外RNAの解析)
  • snRNAの網羅的ライブラリー構築
  • RNA構造マッピング
  • 一般的なRT-PCRやqRT-PCR

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従来品との比較

TGIRT Template-Switching RNA-seq Kitの従来品との比較1

TGIRT-IIIとレトロウィルス由来逆転写酵素の基本的な性質の比較。TGIRT-IIIはレトロウィルス由来逆転写酵素に比べて,高い熱安定性(A),転写効率(B),転写正確性(C)を示す。

TGIRT Template-Switching RNA-seq Kitの従来品との比較2

TGIRT Template Switching RNA-seq kitと他社RNA-seq kitを用いて網羅的RNA解析の比較を行った。試料としてUniversal Human Reference RNA(図中A1-A3)およびHuman Brain Reference RNA (図中B1-B3)を用い,まず,rRNA除去後に断片化した。TGIRT-seqではTGIRT-IIIによるtemplate switchingおよび逆転写反応を同時に実施,Competitor 1および2ではT4 ligase によるアダプター付加後にレトロウィルス由来逆転写酵素でcDNAライブラリーを構築した。cDNA 5’末端へのアダプター処理後,アダプター配列を元にPCRで増幅し,Illumina NextSeq500にて網羅的解析をおこなった。TGIRT-seqでは従来法(Competitor 1/ 2)よりもsmall ncRNAの相対量が多く得られている(上図)。さらにsmall ncRNAの内訳を見ると,立体構造が原因でライブラリー構築が困難とされてきたtRNAがTGIRT-seqでは検出されていることがわかる(下図)。

TGIRT Template-Switching RNA-seq Kitの従来品との比較3

TGIRT-IIIを用いることで,従来発現量の解析が難しかったncRNA(tRNA,miRNA)の各因子の発現量を相対的に比較解析できる。

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操作方法概略

TGIRT Template-Switching RNA-seq Kit
  1. Template switching および 逆転写反応
    TGIRT-III,RNA/DNA ハイブリットをRNA試料に添加することで,template switching および逆転写反応が進行する。
    酵素単品を使用の場合,この操作の前にRNAアダプターとDNAプライマーのアニーリング操作が必要です。
  2. 2つのパターンがあります。
    <網羅的RNA解析>
    得られたcDNAの3’末端に第二アダプターをDNA ligaseを用いて付加する。

    <small RNA解析>
    得られたcDNAの低分子量域を変性PAGEにより精製後に,CircLigase IIにより環状化する。
  3. PCRによる増幅
    付加したアダプターに対するプライマーを用いてPCRで増幅する。必要に応じて,バーコード配列を末端に導入する。

詳細なTGIRT-IIIのプロトコールは下記URLからダウンロードできます。

網羅的RNA解析

small RNA解析

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Reference

  • Mohr, et al., RNA 19, 958~970 (2013).
  • Collins and Nilsen, RNA 19, 1017~1018 (2013).
  • Enyeart., et al., Mobile DNA 5:2 (2014).
  • Katibah., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 111, 12025~12030 (2014).
  • Shen., et al., Science 347, 75~78 (2015).
  • Zheng., et al., Nature Methods, 12, 835~837 (2015).
  • Nottingham., et al., RNA, 22, 597~613 (2016).

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TGIRT-III 酵素単品

[在庫・価格 :2019年10月21日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
TGIRT-III Enzyme(10 reactions)
2週間程度  0
説明文
RNA-seq のライブラリー構築に有用な逆転写酵素TGIRT(Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptases) です。逆転写反応の際にcDNAの5'末端にアダプターを付加するTemplate Switching 活性を有しています。網羅的ライブラリー構築やtRNAを含むnon-cording RNAのライブラリ構築に優れています。 ※製品には反応バッファーは添付されておりません。別途調製が必要です。
別包装品 別包装品あり
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ

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TGIRT-III Enzyme(50 reactions)
2週間程度  0
説明文
RNA-seq のライブラリー構築に有用な逆転写酵素TGIRT(Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptases) です。逆転写反応の際にcDNAの5'末端にアダプターを付加するTemplate Switching 活性を有しています。網羅的ライブラリー構築やtRNAを含むnon-cording RNAのライブラリ構築に優れています。 ※製品には反応バッファーは添付されておりません。別途調製が必要です。
別包装品 別包装品あり
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[在庫・価格 :2019年10月21日 23時07分現在]

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TGIRT-III Enzyme(10 reactions)

文献数:0

  • 商品コード:TGIRT10
  • メーカー:IGX
  • 包装:10μl
  • 価格:¥44,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:

説明文 RNA-seq のライブラリー構築に有用な逆転写酵素TGIRT(Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptases) です。逆転写反応の際にcDNAの5'末端にアダプターを付加するTemplate Switching 活性を有しています。網羅的ライブラリー構築やtRNAを含むnon-cording RNAのライブラリ構築に優れています。 ※製品には反応バッファーは添付されておりません。別途調製が必要です。
別包装品 別包装品あり
法規制等
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TGIRT-III Enzyme(50 reactions)

文献数:0

  • 商品コード:TGIRT50
  • メーカー:IGX
  • 包装:50μl
  • 価格:¥139,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:

説明文 RNA-seq のライブラリー構築に有用な逆転写酵素TGIRT(Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptases) です。逆転写反応の際にcDNAの5'末端にアダプターを付加するTemplate Switching 活性を有しています。網羅的ライブラリー構築やtRNAを含むnon-cording RNAのライブラリ構築に優れています。 ※製品には反応バッファーは添付されておりません。別途調製が必要です。
別包装品 別包装品あり
法規制等
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TGIRT Template-Switching RNA-seq Kit

キット内容

  • TGIRT-III enzyme, 1 x 10 μl (#KTGIRT-10) または 3 x 10 μl (#KTGIRT-25)
  • 10X Primer mix, 50 μl
  • 10 x DTT, 50 μl
  • 5 x Reaction Buffer, 100 μl

[在庫・価格 :2019年10月21日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。
詳細 商品名
  • 商品コード
  • メーカー
  • 包装
  • 価格
  • 在庫
  • 法規制等
納期 文献数
TGIRT Template-Switching RNA-seq kit, ver.2,10tests
2週間程度  0
説明文
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ

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TGIRT Template-Switching RNA-seq kit, ver.2,25tests
2週間程度  0
説明文
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2019年3月1日号 p.21

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[在庫・価格 :2019年10月21日 23時07分現在]

※ 納期として表示している期間は弊社発注日からの「目安」となり、納期を保証する物ではございません。実際には長くかかる場合もございます。ご注意ください。

TGIRT Template-Switching RNA-seq kit, ver.2,10tests

文献数:0

  • 商品コード:kTGIRT-10
  • メーカー:IGX
  • 包装:1kit
  • 価格:¥44,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:

説明文
法規制等
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TGIRT Template-Switching RNA-seq kit, ver.2,25tests

文献数:0

  • 商品コード:kTGIRT-25
  • メーカー:IGX
  • 包装:1kit
  • 価格:¥123,000
  • 在庫:無(未発注)
  • 納期:2週間程度 
  • 法規制等:

説明文
法規制等
保存条件 -20℃ 法規備考
掲載カタログ ニュース2019年3月1日号 p.21

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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