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細胞接着性測定キット CytoSelect 48-Well Cell Adhesion Assay

掲載日情報:2020/06/12 現在Webページ番号:64366

細胞の計数を必要とせず,各種細胞外マトリックスタンパク質に対する細胞の接着性を,比色法または蛍光法により簡便,迅速に測定するキットです。

細胞接着とは

細胞接着は胚形成,遊走/浸潤,組織修復および創傷治癒に関与する複雑なプロセスです。これらのプロセスを実行するために,細胞は細胞骨格の構成要素と複合体を形成し,接着レセプターを介して細胞外マトリックス成分に接着します。それにより,最終的に細胞運動性や分化,増殖,生存に影響を与えます。


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CytoSelect 48-Well Cell Adhesion Assayの特長

  • プレートの各列に,コラーゲンⅠ/Ⅳ,フィブリノーゲン,フィブロネクチン,ラミニンの各種細胞外マトリックスタンパク質がそれぞれ均一にコートされています(下図参照)。
  • 細胞の計数は必要ありません。
  • 比色法(#CBA-070)と蛍光法(#CBA-071)のキットがあります。
ECM Adhesion Plateのプレートレイアウト

ECM Adhesion Plateのプレートレイアウト

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CytoSelect 48-Well Cell Adhesion Assayの操作方法概略

  1. ECMがコートされたプレートに細胞懸濁液を加えて培養する。
  2. 非接着細胞をPBSで洗浄し,取り除く。
  3. 接着細胞を染色し,プレートリーダーあるいは蛍光プレートリーダーで測定する。

CytoSelect 48-Well Cell Adhesion Assayの操作方法は,こちらをご覧下さい。

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比色法による細胞接着の測定例

ECMを介した細胞接着の比色実験例

細胞外マトリックス(ECM)を介した細胞接着の実験例

血清飢餓細胞100,000 cells/wellを1時間 ECM adhesion plateで培養した。接着細胞を染色し(左),抽出後OD560を測定した(右)。BSA:ウシ血清アルブミン,VN:ビトロネクチン,LN:ラミニン,FN:フィブロネクチン,Col:コラーゲン

本実験例は,参考として示したものです。本実験で使用されているECMプレートは,製品に含まれているプレートとは仕様が異なります(製品ではビトロネクチンに代わり,フィブリノーゲンが用いられており,プレートフォーマットも異なります)。

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蛍光法による細胞接着の測定例

ヒトHT-1080細胞の測定例

ヒトHT-1080細胞の測定例

HT-1080細胞を1×PBS中で滴定した。次いで細胞を溶解し,1×Lysis buffer/ CyQuant GR dyeで検出した(細胞懸濁液225μlを4×Lysis buffer 75μlとCyQuant GR dye 1μlに混合した)。

ECMを介した細胞接着の蛍光実験例

細胞外マトリックス(ECM)を介した細胞接着の実験例

血清飢餓細胞を,100,000細胞/ウェルで1時間ECMをコートした48ウェルプレートに接着させた。プロトコルに従って接着細胞をLysis buffer/ CyQuant GR dyeにより溶解,定量した。

本実験例は,参考として示したものです。実際の製品に含まれているプレートとは仕様が異なります(製品版ではビトロネクチンに代わり,フィブリノーゲンが用いられています)。

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CytoSelect 48-Well Cell Adhesion Assayのキット内容

Colorimetric Format Kit
(#CBA-070/CBA-070-5)
Fluorometric Format Kit*
(#CBA-071/CBA-071-5)
ECM adhesion plate(48 well)
Extraction solution4×Lysis buffer
Cell stain solutionCyQuant GR dye

CytoSelect 48-Well Cell Adhesion AssayのFAQは,こちらをご覧下さい。

Fluorometric Format Kit(#CBA-071/CBA-071-5)による測定には,蛍光プレートリーダーが必要です。

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CytoSelect 48-Well Cell Adhesion Assayのキットの価格

[在庫・価格 :2021年05月08日 00時13分現在]

※ 表示されている納期は弊社に在庫が無く、取り寄せた場合の納期目安となります。
詳細 商品名
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CytoSelect 48-well Cell Adhesion Assay (ECM Array, Colorimetric) (48assays)
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[在庫・価格 :2021年05月08日 00時13分現在]

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CytoSelect 48-well Cell Adhesion Assay (ECM Array, Colorimetric) (48assays)

文献数:5

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CytoSelect 48-Well Cell Adhesion AssayのFAQ

Q-1. ECM細胞接着アッセイの操作方法は?
A-1.

■Colorimetric Format(#CBA-070/CBA-070-5)

  1. 滅菌環境下で,ECMプレートを10分間,室温で温める。
  2. 無血清培地に0.1~1.0×106 cells/mlの細胞含む懸濁液を調製する。この際,刺激物質または阻害物質を細胞懸濁液に直接添加することができる。
  3. 細胞懸濁液150μlを各ウェルの内側に添加する(ネガティブコントロールとしてBSAをコートしたウェルを含む)。
  4. 細胞培養用のインキュベーター中で30~90分間インキュベートする。
  5. 各ウェルから培地を注意深く廃棄または吸引する。この際,各ウェルを乾燥させないようにする。次いで各ウェルをPBS 250μlで4~5回,穏やかに洗浄する。
  6. 各ウェルからPBSを吸引し,Cell Stain Solution 200μlを添加する。室温で10分間インキュベートする。
  7. 各ウェルからCell stain solutionを廃棄または吸引する。各ウェルを脱イオン水500μlで4~5回洗浄する。
  8. 最終洗浄液を廃棄し,ウェルを乾燥させる。
  9. 各ウェルにExtraction solution 200μlを添加し,次いでオービタルシェーカー上で10分間インキュベートする。
  10. 各抽出試料150μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移し,プレートリーダーによりOD560の吸光度を測定する。

■Fluorometric Format(#CBA-071/CBA-071-5)

  1. 滅菌環境下で,ECMプレートを10分間,室温で温める。
  2. 無血清培地に0.1~1.0×106 cells/mlの細胞含む懸濁液を調製する。この際,刺激物質または阻害物質を細胞懸濁液に直接添加することができる。
  3. 細胞懸濁液150μlを各ウェルの内側に添加する(ネガティブコントロールとしてBSAをコートしたウェルを含む)。
  4. 細胞培養用のインキュベーター中で30~90分間インキュベートする。
  5. 各ウェルから培地を注意深く廃棄または吸引する。この際,各ウェルを乾燥させないようにする。次いで各ウェルをPBS 250μlで4~5回,穏やかに洗浄する。
  6. CyQuant GR dyeをLysis bufferを用いて1:300に希釈し,十分量の1×Lysis buffer/CyQuant GR dye solutionを調製する(調製例:色素4μlを4×Lysis buffer 300μlと900μlのdH2Oに添加する)。
  7. 細胞を含む各ウェルに1×Lysis buffer/CyQuant GR dye solution 200μlを添加する。振とうしながら室温下で20分間インキュベートする。
  8. 各抽出試料150μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移し,蛍光プレートリーダー(励起 480 nm/蛍光 520 nm)により蛍光強度を測定する。

Q-2. マトリックスタンパク質の由来は?
A-2. プレートにコートされているECMタンパク質は,マウス・ラミニン,ウシ・コラーゲンⅠ,ヒト・フィブロネクチン,ヒト・コラーゲンⅣ,ヒト・フィブリノーゲンです。

Q-3. BSAがネガティブコントロールとして使用されるのはなぜですか?
A-3. ECMへの細胞接着は全てインテグリンレセプターを介して行われ,細胞はBSAをコートしたウェルには接着しないためにBSAがネガティブコントロールとして使用されています。

Q-4. プレートは全て1回で全てを使い切る必要がありますか?
A-4. 製品はストリップウェルプレートで提供されていませんが,未使用のウェルは溶液が他の未使用のウェルに漏れ出ていない限り後ほどの実験に使用可能です。再使用の前に,プレートをフードの下でUVライトに照射することをお勧めします。

Q-5. どのくらいのコンフルエンシーが推奨されますか?
A-5. 細胞接着アッセイには,50~75%のコンフルエンシーの細胞を推奨します。

Q-6. なぜ無血清培地がプロトコルで必要とされているのですか?
A-6. 血清には多くのECMが含まれており,これらがプレートのウェルにコートされる恐れがあるため,無血清培地を使用することは重要です。血清培地を使用した場合には結果が複雑となり,細胞がプレートにコートされた特有のタンパク質に結合したのか,血清中に含まれる多くのECMの一つに結合したのかを知ることが不可能になります。多くの細胞株にとって10%FBSが生育に好ましい場合でも,このアッセイの間にFBSなしで短時間インキュベートしても通常は問題にはなることはありません。

Q-7. キットはECMタンパク質とは別の種の細胞にも適合しますか?
A-7. 細胞のECMタンパク質への接着は,生物種の適合性やECMタンパク質が生物種間においてどのくらい良く保存されているかということには依存しません。むしろ接着性は,結合に必要なインテグリンの発現の有無に依存します。例えば,マウス細胞がフィブロネクチン用にインテグリンレセプターを発現している場合,その細胞はヒトおよびマウスのフィブロネクチンの両方に結合することができるでしょう。このアッセイがマウス細胞と適合するかどうかを知るためには,使用される細胞株がこれらのECMタンパク質のためのインテグリンレセプターを発現するかどうかを決定する必要があります。

Q-8. 細胞懸濁液調製の際に使用するトリプシンは,細胞表層レセプターを切断しますか?
A-8. トリプシン/EDTAは,細胞接着アッセイの細胞懸濁液の調製の際の細胞の剥離に常に用いられます。細胞接着レセプターは,トリプシン/EDTAによる剥離後も素早く再生します。トリプシン/EDTAが細胞にとって強すぎると考えられる場合には,緩和な無酵素細胞剥離試薬Versene(0.2gEDTA(4Na) /1L PBS)の使用をご検討下さい。

Q-9. ポジティブコントロールとして使用できる細胞株は?
A-9. MDA-MB-231,HT-1080,HEK293細胞についてこのアッセイを試験していますが,MDA-MB-231を用いた場合,個々のECMタンパク質に対してほとんどの細胞が接着細胞でした。これらの細胞は,この細胞接着アッセイの良いポジティブコントロールとなるでしょう。こちらの実験例を併せてご参照下さい。

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お問い合わせ先

(テクニカルサポート 試薬担当)

reagent@funakoshi.co.jp

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