タンパク質カルボニル測定キット　 OxiSelect Protein Carbonyl ELISA Kit

タンパク質カルボニルを迅速かつ高感度（＜4 mg/ml）に定量するELISAキットです。タンパク質試料の濃縮の必要がなく、濃縮沈殿操作に伴うカルボニルやタンパク質の損失を防げるため、精度および再現性の高い測定結果が得られます。

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※本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

TO (MEF)、HeLa、MDA-231細胞ライセート中のタンパク質カルボニル量の定量

Q-1. 蛍光または分光光度フォーマットと比較し、タンパク質カルボニルELISAキットを使用する利点は何ですか？

A-1.Cell Biolab社のタンパク質カルボニルELISAキットは、分光光度アッセイより約5～10倍高感度で、分光光度フォーマットでは1アッセイ当たり250μgのタンパク質が必要なところ、わずか1μgで測定できます。分光光度フォーマットでは個々のチューブで1試料ずつ測定しますが、ELISAキットではより多くの試料を1度に測定できます。分光光度キットフォーマットは、ELISAプレートリーダーをお持ちでない研究室用にデザインされた製品です。

Q-2. 試料の調製方法は?

A-2.タンパク質カルボニルELISAキットは、すべてのタンパク質試料を10 μg/mLに希釈し、プレートに吸着させる必要があります。細胞／組織ライセートの調製の際にTriton X-100やNP-40などの界面活性剤が存在すると、タンパク質のプレートへの吸着を妨害するため、使用は避けて下さい。細胞／組織は、プロテアーゼ阻害物質と0.005% Butylated hydroxytolueneを含むPBSに再懸濁し、ホモジネートまたは超音波処理を行った後、12,000gで10分間遠心し、上清をライセートとして使用して下さい。タンパク質濃度はBCAやBradford法で測定し、PBS中10 μg/mlの濃度に調製後、プレートにコートして下さい。

Q-3. シグナルを増強するため、プレートにコートするタンパク質量を増やすことができますか？

A-3.コートするタンパク量を増やしてもシグナルは増えません。1ウェル当たり10 μg/mlのタンパク質を 100 μlコートしますが、この濃度はタンパク質カルボニルがウェルに結合できる最大量を上回っているため、タンパク質カルボニルを追加してもタンパク質の吸着量やシグナルは増加しません。

Q-4. 試料中のタンパク質量を変化させても良いですか？

A-4.すべての試料は10 μg/mlに調製して下さい。抗原を吸着したプレートを用いた間接ELISAで測定するため、すべての試料を同じ濃度にする必要があります。試料のタンパク質濃度をBCAまたはBradford法などで測定し、1×PBS中で10 μg/mlとなるように希釈します。

Q-5. 試料を数点持っていますが、全ての試料のタンパク質濃度を求める必要がありますか？

A-5.全ての試料のタンパク質濃度を測定することは現実的ではないので、いくつか試料を測定してその平均値を全試料の濃度概算値として用いることができます。

Q-6. 血液試料をヘパリンまたはEDTAを用いて調製できますか？

A-6.ライセート、血清、血漿に関わらずタンパク質カルボニル修飾物を含む試料に用いることができます。血漿試料の回収にヘパリンまたはEDTAを使用でき、いずれも測定を妨害しません。

Q-7. 尿試料は測定できますか？

A-7.はい、可能です。BCAかBradford のタンパク質アッセイ実施後にPBS中で10 μg/ml となるように試料を希釈して下さい。

Q-8. どの試料が分析を阻害する高濃度の核酸を含んでいますか？

A-8.ほとんどの試料では核酸の除去は必要ありません。ただし、全細胞ライセートを使用する場合においては、必要となります。ケト基を含む核酸はDNPH試薬と反応するため、誤シグナルを生じます。このステップが必要か不明の場合には、必要に応じて沈降操作を行った試料、行っていない試料を用意して判断できます。核酸を除去するためには、硫酸化ストレプトマイシンかPEIをそれぞれ最終濃度1％、0.5％となるように加えて、30分間室温でインキュベートし、6,000g、4℃で10分間遠心分離を行って核酸沈殿物を除去します。

Q-9. 核酸除去に硫酸化ストレプトマイシンやPEIの代わりにベンゾネースを用いることはできますか？

A-9.調製時にタンパク質を追加しない限り、どのようなDNA／RNA除去法も利用できます。添加したタンパク質には、分析結果を阻害するカルボニル基が含まれている可能性があります。

Q-10. このアッセイは種特異的ですか?

A-10.種に関わらずタンパク質カルボニル基の構造は同じです。従って、どの生物種のタンパク質試料にも、用いることができます。

Q-11. 37℃で2時間と4℃で一晩インキュベートではどちらが良いですか？

A-11.長時間のインキュベートを推奨しますが、必須ではありません。37℃で2時間のインキュベーションでも良好な結果が得られます。一定の時間を設定している限り、インキュベーション時間によってアッセイにおけるバラツキの影響はありません。

Q-12. 反応停止液を加えるタイミングは？

A-12.どのELISAの場合でも一般的ですが、呈色時間は一定ではないので長時間のインキュベーションを行うようにして下さい。 TMB基質を加えたら、青色がゆっくり呈色し、停止液を加えると黄色に変色します。もし試料が基質溶液で長時間インキュベーションした場合には、飽和します。いつ停止液を加えるか決定するために、標準曲線作成用のウェルを見てください。最も濃度の高いウェルで明るい青色が、最も低濃度のウェルで薄い着色が観察できた時点で停止液を添加すると良いでしょう。良好な勾配が観察できた際には、停止液を加え、直ちにプレートを測定して下さい。試料間の色の違いに関わらず、マルチチャンネルピペットですべてのウェルに同時に停止液を加えて下さい。

Q-13. どうやって標準曲線を作成して結果を算出したらよいですか？

A-13.標準曲線から濃度を求めるための最善の方法は4-パラメーター曲線適合プログラムを用いることですが、そのようなソフトウェアをがければエクセルを用いることができます。標準曲線を描いた後、直線を作成します。ELISAで作成した標準曲線は通常直線にはなりませんが、試料の数値が適正範囲内であれば上と下の数値を除けば直線が作成できます。中央部の標準曲線が最も感度が高く、試料の定量に適しています。直線の方程式は、未知濃度xについて、y=mx+bとなり、x=(OD値-b)/mで算出できます。

Q-14. 低濃度にも関わらず標準曲線のOD値が高くなってしまいます

A-14.高いシグナルや早い呈色は、洗浄操作で除去しきれず残ってしまったDNPHによる可能性があります。DNPHは非常に粘性の高い分子なので、プロトコルのステップ5の洗浄操作は、遊離DNPHを除くために非常に重要です。
　　呈色時間を短縮するために、完全に洗浄を行い、標準曲線を繰り返しアッセイすることを推奨します。他の方法は、ELISAでの抗体量を少なくすることです。例えば、1：1000の一次抗体と二次抗体の希釈率の代わりに、1：2000で調製します。

Q-15. 試料の値が標準曲線より高くなった場合にはどうしたら良いですか？

A-15.この場合には、タンパク質濃度を薄めずに試料を希釈する必要があります。標準曲線作成時に調製した10 μg/mlの還元型BSAで10 μg/mlのタンパク質試料を希釈して下さい。標準曲線の範囲に収めるために、2～3回希釈した試料も作製すると良いでしょう。