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CypExpress, for robust metabolite identification and production
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CypExpress, for robust metabolite identification and production
代謝産物の同定・産生に有用なヒトシトクロムP450(CYP)とP450オキシドレダクターゼ CypExpress, for robust metabolite identification and production
掲載日情報：2015/02/02 現在Webページ番号：63397
組換え体ヒトシトクロムP450(CYP)とP450オキシドレダクターゼを共発現させたピキア属酵母（Pichia yeast）の乾燥粉末です。哺乳動物のミクロソームや他の発現システムよりも長時間活性を維持し、多くの代謝産物が得られます。
追加しました。
- 組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの特長
- 組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの操作方法
- 組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの使用例
- 組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの価格
- コントロールの価格
組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの特長
- ヒトシトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを共発現させた後、酵母不活性化・透過処理し、乾燥粉末にしています。
- 使用法は簡便で、本製品を添加し一晩混合するだけで代謝反応は進行し、その後遠心により上清を回収します。
- 室温でも安定で、数時間～一晩でも触媒活性を維持し、また再利用も可能です。
- トリスまたはリン酸緩衝溶液で反応します。また、Glucose-6-PosphateやNADPの添加によって反応を促進することも可能です。
- G6PDH（Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase）の添加は必要ありません。
- 夾雑物が少ないため、HPLCによる代謝産物の同定や精製が容易です。
- 基質濃度が高い場合でも高効率に酵素基質反応が起こります。
- ロット間の高い再現性が得られます。
- 薬物代謝産物のスクリーニング・同定、MIST(metabolite in safety test)用薬物代謝物の産生、およびP450阻害物質のスクリーニングを迅速、かつ安価に行うことできます。
他のシステムとの比較
| システム | シトクロムP450のアイソフォーム | G6PDHの添加 | インキュベーション温度 | 反応用バッファー | 反応時間 | 費用 | 副産物 | 使いやすさ | コストあたりの代謝産物量 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| ミクロソーム | 複数 | 必要 | 37℃ | リン酸バッファー | 30分 | ++ | 多い | △ | ◎ |
| バクテリア | 単一 | ++ | 少ない | △ | ○ | ||||
| バキュロウイルス | ++++ | × | △ | ||||||
| 本製品 | 不要 | 20～37℃ | リン酸バッファー、トリスバッファーなど | ～数日 | + | ◎ | ◎◎ |
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組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの操作方法
(１）24ウェルマイクロプレートでの代謝産物の迅速スクリーニング法
反応溶液： 50 mMリン酸カリウムバッファー（KPi）、pH7.5
最終基質濃度： 250～300μM （CypExpressはDMSO/DMF2の2%未満で使用可能）
- CypExpressの凍結粉末を20～30分間室温で融解する。KPi中で必要量のCypExpressの100 mg/mlの均一懸濁液を調製する。HPLC/MSのみを検出に用いる場合など、必要に応じてバックグラウンド低下のため粉末の前洗浄を行なう。
- 最終量200μlの粉末と適量の基質を24ウェルプレートに加える。
- オービタルシェーカー上で、30℃、600rpmで3～4時間インキュベートする。
- HPLCの移動相の溶媒を反応液に3：2の割合で加えて反応を停止する。
- 30分間以内、室温で静置し沈殿を生じさせる。
- 20℃、14,000×gで10分間、遠心分離を行う。
- 0.22μmのフィルターで上清をろ過する。
- ろ過した試料の10～20μlをHPLCまたはLC-MSに注入し、標準物質で基質の消失と代謝産物の確認を行う。できればMSと数種のイオンを用いてモニタリングを行うのが望ましい。
代謝産物単離のスケールアップ（5 mg以上）
最適基質濃度（0～500／1000μM）と反応時間については、pH7.5で上述の迅速スクリーニング条件で24ウェルマイクロプレートか1 mlのチューブを用いて決定しておくのが望ましい。
- CypExpressの凍結粉末を20～30分間室温で融解する。
- 粉末20gを秤量し、1.8～2.4Lの大きめのコニカルフラスコ中でpH7.5の50 mM KPiの320 ml中に加え洗浄する。この操作はHPLCできれいな代謝産物の入手やバックグラウンド低下のための重要なステップである。200 ml以上では、粉末と洗浄量は適量に調節する。
- 均一な細胞懸濁液を30℃で約20分間、175 rpmでオービタルシェーカーを用いてインキュベートする。その後、4℃で4分間、6,000 gで遠心分離を行う。
- 200 mlバッファー中で再懸濁する。
- 12 mMのD-glucose-6-phosphate-Na(G6Pと最適基質量)を添加する。
- 反応混合物をコニカルフラスコ（1.8～2.4L）で 30℃、225 rpmでインキュベートする。最適反応時間は前述の通り決定する。
- 6000×g、4℃で4分間遠心分離を行い、1回目反応の遠心上清を保存する。HPLC移動相を加え沈殿させた後に、500μｌを採取する。
- 2回目の反応では、ペレットをバッファーに再懸濁し、12 mMのG6P（反応液合計200 ml）を加える。ここで基質の追加は必要ない。
- 反応混合液を最適時間インキュベートする。
- 500μｌの懸濁液と、1 mlの反応混合液を遠心分離後500μlの細胞を含まない反応混合液を別々にマイクロ遠心管に加える。750μlのHPLC移動相を添加し、30分間静置し沈殿させる。両方の試料を20℃で14,000×gで10分間遠心し、両方の懸濁液をろ過し、両試料中の代謝産物の形成を分析する。
- 2サイクルの懸濁液中に代謝産物が80％以上占める場合には、Step10のHPLC移動相で高分子を沈殿させた後に両方のサイクルの懸濁液を混合して代謝産物を単離する。
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組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの使用例
パフォーマンスの比較
Testosterone（500 μM）を、CypExpress3A4、ラット肝臓ミクロソーム、または組換え体ヒトCYP3A4を含むE.coli膜とリン酸バッファー中で5時間（Cycle 1）インキュベートした。反応後、HPLCにより反応産物6β-Hydroxytestosteroneの量を測定した。
[試料]
Cycle1：反応させた試料の低速遠心分離後の上清
Cycle2：Cycle1で遠心した際に得られたペレットを、NADPとG6Pを含むバッファーで再懸濁した試料
| CypExpress Isoform | サイクル数 | 基質／反応 | 産物／収量 |
|---|---|---|---|
| 2C9 | 1×1.5 hour | Diclofenac/59.2 mg in 400 ml | 4'-hydroxydiclofenac/53.6 mg（90.5％） |
| 2D6 | 2×3 hour | Dextromethorphan/27 mg in 200 ml | Dextrorphan/7.5 mg（27.8％） |
| 3A4 | 2×3 hour | Testosterone/14.4 mg in 200 ml | 6β-Testosterone/7.01 mg（48.7％） |
パイロットスケールでの反応
20 gのCypExpressを、NaG6P（12 mM）と基質（250～500 μM）が含まれた50 mM のKPiバッファー（pH 7.5）に懸濁した。混合液を30℃で所定の時間インキュベートし、HPLCにより反応産物量を測定した。
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組換え体シトクロムP450とP450オキシドレダクターゼを持つCypExpressの価格
[在庫・価格 ：2024年04月25日 14時15分現在]
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CypExpress 1A2 |
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CypExpress 1A2 |
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CypExpress 2C9 |
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CypExpress 2C9 |
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CypExpress 2D6 |
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CypExpress 2D6 |
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CypExpress 3A4 |
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CypExpress 3A4 |
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CypExpress 2C19 |
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CypExpress 2C19 |
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[在庫・価格 ：2024年04月25日 14時15分現在]
CypExpress 1A2
文献数： 0
- 商品コード：CE1A2.1
- メーカー：OBR
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- 法規制等：カルタヘナ該当品
CypExpress 1A2
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- 商品コード：CE1A2.10
- メーカー：OBR
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CypExpress 2C9
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- 商品コード：CE2C9.1
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- 法規制等：カルタヘナ該当品
| 説明文 |
組換え体ヒトCYP 2C9およびP450 NADPHオキシドレダクターゼを共発現させた酵母の粉末。薬物代謝産物のスクリーニング，同定，安価な産生およびP450阻害物質のスクリーニングに有用。 |
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CypExpress 2C9
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- 法規制等：カルタヘナ該当品
| 説明文 |
組換え体ヒトCYP 2C9およびP450 NADPHオキシドレダクターゼを共発現させた酵母の粉末。薬物代謝産物のスクリーニング，同定，安価な産生およびP450阻害物質のスクリーニングに有用。 |
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| 掲載カタログ |
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- 法規制等：カルタヘナ該当品
| 説明文 |
組換え体ヒトCYP 2D6およびP450 NADPHオキシドレダクターゼを共発現させた酵母の粉末。薬物代謝産物のスクリーニング，同定，安価な生産およびP450阻害物質のスクリーニングに有用。 |
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組換え体ヒトCYP 2D6およびP450 NADPHオキシドレダクターゼを共発現させた酵母の粉末。薬物代謝産物のスクリーニング，同定，安価な生産およびP450阻害物質のスクリーニングに有用。 |
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組換え体ヒトCYP 3A4およびP450 NADPHオキシドレダクターゼを共発現させた酵母の粉末。薬物代謝産物のスクリーニング，同定，安価な生産およびP450阻害物質のスクリーニングに有用。 |
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- 法規制等：カルタヘナ該当品
| 説明文 |
組換え体ヒトCYP 3A4およびP450 NADPHオキシドレダクターゼを共発現させた酵母の粉末。薬物代謝産物のスクリーニング，同定，安価な生産およびP450阻害物質のスクリーニングに有用。 |
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CypExpress 2C19
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- 商品コード：CE2C19.1
- メーカー：OBR
- 包装：1g
- 価格：¥121,000
- 在庫：無(未発注)
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- 法規制等：カルタヘナ該当品
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コントロールの価格
[在庫・価格 ：2024年04月25日 14時15分現在]
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CypExpress Control |
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CypExpress Control |
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[在庫・価格 ：2024年04月25日 14時15分現在]
CypExpress Control
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- 商品コード：CENull.1
- メーカー：OBR
- 包装：1g
- 価格：¥61,000
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