迅速かつ高い抗体価が得られる強力なアジュバント!! TiterMax Gold

■ 全般的な質問

Q1. TiterMax には何が含まれていますか。
A1. 以下のコンポーネントが含まれています。

Q2. ブロック重合体CRL-8300とは何ですか。
A2. CRL-8300は、疎水性のポリオキシプロピレン（POP）と親水性のポリオキシエチレン（POE）のポリマーブロック、あるいはポリマー鎖から成る合成ポリマーです。ブロック共重合体のアジュバント活性については、1981年に Hunter らによって報告されました（Hunter R. et al., J. Immunol., 127, 1244～1250）。CRL-8300は、多くのブロック重合体の中から、アジュバント性能と、スクアレンと共に安定な油中水型エマルジョンを形成する能力の高さで選ばれました。

Q3. TiterMaxは何度で保存すればいいのですか。
A3. 4℃で保存して下さい。

Q4. TiterMaxは、抗原と混合しエマルジョンを形成させてから保存できますか。
A4. 50:50の油中水型エマルジョンは、使用した抗原の安定性により、室温, 4℃, -20℃, あるいは -70℃で保存が可能です。保存によりエマルジョンの約20%が油分として分離します。再度免疫したいときには、エマルジョンをシリンジに入れたままで再乳化することができます。エマルジョンの安定性は使用した抗体によります。

Q5. TiterMaxの信頼性はどうですか。
A5. TiterMaxにはFCA（Freund's complete adjuvant）と同等の信頼性と再現性があります。TiterMaxは FCAと同様、どのような抗原でも油中水型のエマルジョンに取込むことができるからです。一方、最近開発された多くのアジュバントは、単に抗原を吸着作用で結合するだけのものです。もし、抗原が吸着されなければ、高タイターは得られません。TiterMaxは、油中水型のエマルジョン性能と、ブロック重合体自体の性能とを組み合わせることにより、高い再現性を示します。

Q6. 何ml入りの TiterMaxを買えば良いのでしょうか。
A6. TiterMaxには、1.0, 3.0, 5.0, および 20.0 ml 入りの商品があり、研究の目的に合わせて購入できます（2016年7月現在）。

■ 有効性

Q7. 以下の各項目につき、TiterMax の作用を教えて下さい。
A7.

モノクローナル抗体作製には「標準プロトコール」はなく、多くの異なる方法が有効であることが知られています。更に、モノクローナル抗体作製プロコトールは、抗体産生細胞数を増加させるために使用される場合を除き、アジュバントには依存しません。TiterMaxは、FCAを使用して免疫が成功した抗体なら全て使用できると思います。

Q8. TiterMaxを使えば高タイターの抗体が得られますか。
A8. 最適な免疫スケジュールは、使用する抗体、動物種、研究者のニーズによって様々です。TiterMaxを使用すれば、多くの場合ブーストしなくても、十分に使用に耐える高タイターの抗体を得ることができます。しかし、TiterMaxを使ってブーストした方が安全とも言えます。というのは、TiterMaxは油中水型エマルジョンで、FCAを使用して成功した抗体作製法ならどのようなプロトコールでも使用可能と考えられるからです。TiterMaxを使えば、高タイターの抗体が迅速に得られるため、お金と時間の節約になり、生産性を向上させながら、期待通りの免疫反応を達成することができます。

■ エマルジョン

Q9. エマルジョンの作製は、どのようにすれば良いのでしょうか。
A9. TiterMaxのエマルジョンは、FCAと同様の方法で作製できます。しかし、一回あたりの注射量がマイクロリットル単位なので注意が必要です。お持ちの注射用具およびエマルジョンの想定使用量によっていくつかの選択肢があります。簡単さとエマルジョンの無駄の無さから、以下の2つの方法がお薦めです。1つは “Double hub needle method”で、注射針の針管の両端に「針基（はりもと）、注射器の筒先を挿す部分」が付いている器具を使用します。もう1つは、先端に小さなペッスルが付いたグラインダー（フナコシが販売するMini Cordless Grinder、#CG-4Aの様な器具）を使用する”Kontes Pellet Pestle homogenizer method”です。後者は少量のエマルジョン作製に向いています、

Q10. TiterMaxの最適なエマルジョン比や抗原濃度域はありますか。
A10. 抗原水溶液：TiterMax比が 50～90%のとき良好な免疫反応が起こります。しかし、多くの場合は 50:50の比率の油中水型エマルジョンが最適です。水の割合を増やすに連れて、有効成分である油分が減っていることを忘れてはいけません。研究者は個々の抗原によって注意深く使用量を少しずつ変化させ、エマルジョンの配合組成を決定しなければなりません。我々の経験では、1回投与あたり抗原量を15～125μgの範囲で用い、高タイターの抗体を得ることができています。

Q11. TiterMaxでエマルジョンを作ろうとしていますが、未だ液状です。抗原のタンパク質はトリス緩衝液に溶かしてあります。どのようにすれば適切な硬度になるでしょうか。
A11. まず、きちんと乳化のプロトコルに則って行ったか、特に事前に適切にボルテックスを行ったかを確認して下さい。何人かの研究者から、トリス緩衝液を使用した場合、混合物が液体粘度（liquid consistency）を示したという報告が上がっています。少しずつTiterMaxを加えて、ホイップクリームのような適切な粘度になるようにして下さい。乳化した液滴を水に落とすと水面に浮きます。

Q12. 私の抗体は0.5% Triton X-100を含んでいます。界面活性作用で TiterMaxのエマルジョンが破壊されませんか。
A12. まず、抗体を加えず0.5% Trion X-100 だけで安定なエマルジョンが形成されるかどうかを確認して下さい。もし、エマルジョンが安定なら、抗体を加えても大丈夫でしょう。過去には1.0% Trion X-100存在下でも成功したという報告があります。

Q13. 抗原としてSDS-PAGEのグラジエントゲルのバンドを含んでいる場合、TiterMaxで乳化することはできますか。また、ガラス製注射筒を使うことは可能ですか。
A13. まず、所属施設のIACUC（動物実験委員会）がアクリルアミドの動物への注射を許可しているかどうかを確認して下さい。もし、許可されているのなら、ゲルからバンドを切り出して使用して下さい。もし、バッファーが除ききれず、ゲルに残っていても気にする必要はありません。容積を見ながらピンセットなどでゲルを挟んで注射筒に入れ、適量のTiterMaxを混ぜ、通常通りの乳化法でエマルジョンを作製します。注射筒はガラス製でもプラスチック製でも使用可能です。

■ 毒性

Q14. 何故TiterMaxは、FCAよりも毒性が低いのでしょうか。
A14. FCAの毒性は、ミネラルオイルと結核死菌の組み合わせによります。TiterMaxには、タンパク質、ペプチド、植物由来成分などは何も含まれていません。含まれているのは、通常の生物の構成成分で生分解性のスクアレンと新規に開発されたブロック重合体アジュバントです。TiterMaxは、乳化剤と安定化剤、有効性と毒性とのバランスを考えた最適な混合比率で作られています。TiterMaxによる局所炎症は、使用する抗原の性質と量により変化します。他の独立した試験機関により確認された我々の研究によると、弱い一過性の反応が見られるだけです。TiterMaxでは、ツベルクリンの過敏症や肉芽腫、アジュバント関節炎は見られません。

TiterMaxは、抗体とアジュバントとを油中水型のエマルジョンに取り込むことにより、抗原を免疫系に効率的に届け、免疫を効果的に行う一方 、FCAが示す副作用を最小にすることができます。

Q15. ウサギやマウスで、毒性を示さない最高投与量はありますか。
A15. 注射箇所あたり50μl 以下では毒性を示さないはずです。しかし、これは投与経路と使用する抗体によります。

Q16. どのような注射経路が望ましいのでしょうか。
A16. TiterMaxに関しても、他のアジュバントで成功を収めているような投与方式を取ることが良いと思われます。主な研究者によると、腹腔内投与よりも皮下注射で行った方が優れた抗体産生を導くようです。

Q17. 初回免疫をFCAで行いました。TiterMaxでブーストすることはできますか。
A17. 可能ですが、TiterMaxのみを用いた場合に対し、異なったサブクラスの抗体を産生する可能性があります。

Q18. マウスに免疫して、いつから採血できますか。毎週可能ですか。それともブーストした方がいいですか。
A18. 初回の免疫から採血まで4～6週間待つべきです。採血量が0.25～0.3 mlを超えなければ毎週採血することは可能です。タイターが下降し始めたら、通常使用量かその半量でブーストすることができます。ブーストしてから4週間待った方が良い結果が得られます。

Q19. マウスにTiterMaxを腹腔内投与する場合、1回あたりどのくらい注射すればいいですか。
A19. 腹腔内投与の場合には 0.1～0.5 mlのエマルジョンを投与することをお薦めします。多くの研究も0.5 mlの投与で最上の結果が得られたとしています。もし必要な場合は、1.0 mlまで増量しても良いのですが、お薦めではありません。できれば、腹腔内ではなく皮下注射での投与を検討してみて下さい。

Q20. ウサギを免疫する予定なのですが、ブーストした方がいいですか。何人かの同僚は、ブーストで出血や壊死を伴うアルサス反応が起こったと言っています。
A20. TiterMaxは非常に低毒性ですが、高タイターの抗体産生が起こることから、初回免疫箇所に局所的なアルサス反応を起こしやすい可能性があります。少量のエマルジョンを複数の部位に投与すれば、高タイターの抗体産生能を維持したままアルサス反応を最小にし得ると思います。多くの研究者は、TiterMaxではブーストは不要と報告していますが、もしブーストが必要な場合は、まず抗体のタイターを測定し、これが高ければTiterMaxの投与量を半量あるいはそれ以下にしてみて下さい。アジュバントを使わない、可溶性抗原のみを投与することも考慮して下さい。いずれの場合も、投与は複数の部位で行って下さい。

■ 抗原

Q21.アジ化ナトリウムやチメロサールなどの防腐剤を加えて、抗原を保存しています。これらは TiterMaxのエマルジョンの使用期限に影響しますか。
A21. どちらもTiterMaxのエマルジョンの使用期限には影響しませんが、防腐剤濃度が高ければ混合して作製したエマルジョンは毒性を持つことになります。

Q22. TiterMaxを使って最高の結果が得られる抗原にはどのようなものがありますか。
A22. 現在までのところ、下に列記した抗原について成功例が報告されています。TiterMaxはペプチドや免疫原性の低い物質に対しても機能するようです。タンパク質やペプチドに関しては、フロイントのアジュバントでは作製できなかったエピトープに対しても高タイターの抗体が得られたという報告があります。一方、TiterMaxはタンパク質を含まないような純粋な炭水化物では抗体産生は見られません。このようなユーザーからの情報はいつでも受け付けていますので、最新の成功例についてはお問い合わせ下さい。

Q23. 抗原に界面活性剤が混入している場合、TiterMaxのエマルジョンに影響しますか。
A23. 高濃度の界面活性剤などを含む免疫原は、乳化に影響する可能性があります。我々の経験では、アクリルアミド中のSDSが 1.0%を超える場合、あるいは尿素濃度が1 Mを超える場合は TiterMaxの乳化作用が著しく低下します。このカテゴリーの物質では同様の結果となります。一般的に、ある種の界面活性物質は「乳化破壊物質」としてエマルジョンを壊します。TiterMaxに含まれる最新技術の乳化剤と微粒子安定剤は、界面活性剤が過剰に含まれることがなければ、乳化破壊作用を克服する能力があります。

TiterMax Gold をアジュバントに用いた免疫による
ウイルス抗原に反応する異なるT 細胞サブセットの活性化

東京理科大学　生命医科学研究所　分子病態学部門
理化学研究所　統合医科学研究センター　サイトカイン制御研究チーム
久保允人 教授　谷津宏紀 様

TiterMax Gold（以下、TiterMaxとする）は、非イオン性合成コポリマーと代謝可能オイル：スクアレンから成る油中水型乳剤である。スクアレンはサメ類の肝油から精製される不飽和脂肪酸の一種であり、サプリメントなどに使われている。一方、合成コポリマーは有害な局所反応を引き起こす毒性を軽減するために、精製されたグリコシドであるシリカ粒子でコーティングされている。TiterMaxは、既存のFreund’s Complete Adjuvant（FCA）に比べて毒性が低く、TiterMaxと同様にスクアレンを含む油性アジュバントは、ヒトに対するインフルエンザワクチンに使用されている。

本実験では、 インフルエンザウイルスの核タンパク質をコードするペプチド（NP_264-279）に対するワクチンを、TiterMaxとともに足蹠に免疫した場合と腹腔内に免疫した場合で、どのようなT 細胞サブセットが反応してくるのかを、インターフェロンγ（IFN-γ）の発現追跡ができるレポーターマウスと、ペプチド-MHCクラスⅡから構成されるテトラマー（MHC2/NP_264-279）を用いて解析した。

TiterMaxを使って足蹠に免疫した場合、鼠径リンパ節にはIFN-γを産生する1型ヘルパーT（Th1）細胞が強く誘導されたのに対して、腹腔内に免疫した場合は脾臓内に別のヘルパーT細胞サブセットを誘導した。このサブセットは、Th1同様IFN-γを産生するCXCR3＋CXCR5＋のT細胞サブセットで、抗体産生系に主に働く濾胞型T（TFH）細胞に相当する。このことから、TiterMaxはT細胞の活性化において非常に高いアジュバンド活性を有しており、ウイルス抗原に対するTh1反応や抗体産生反応を司るTFH細胞を誘導できることが明らかにされた（図-1）。また、TiterMaxはAlumアジュバントに比べて、IFN-γ産生TFHの高い誘導能がみられた（図-2）。

　図-1 　TiterMax の足蹠免疫と腹腔免疫の効果の違い　

IFN-γ venusレポーターマウスの足蹠と腹腔にTiterMaxとともにインフルエンザペプチドワクチンNP_264-279を免疫した。
2週間後、鼠径リンパ節と脾臓における抗原結合T細胞をMHC2テトラマーを用いて濃縮後、CXCR3とCXCR5の発現をみた。

　図-2 　TiterMaxとAlum間でのアジュバントの効果の違い　

マウス腹腔にTiterMaxまたはAlumをアジュバントとして免疫を行った。脾臓におけるCD4 T細胞でのCXCR3とCXCR5の発現をみた。TiterMaxはAlumに比べ、IFN-γ産生TFHの高い誘導能がみられた。