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磁気ビーズによる目的細胞への高効率かつ特異的なウイルス導入用試薬 Viro-MICST / Viro-MICST Stem

掲載日情報：2025/01/10 現在Webページ番号：5678

オズ バイオサイエンス /
OZ Biosciences
[メーカー略称：OZB]

Viro-MICSTは、OZ Bioisciences社のMagnetofectionとMiltenyi社のMACS®を組み合わせて開発したi-MICST（integrated Magnetic Immuno-cell Sorting and Transfection / Transduction）テクノロジーを用いたウイルス導入用の新しいナノ粒子試薬です。Viro-MICSTが結合したウイルス粒子と、特異的抗体により磁気ビーズ標識した目的細胞を同時に磁性カラムにアプライすることにより、目的細胞の分離濃縮とウイルス導入を同時に行え、操作の簡便化と高効率かつ特異的な導入を可能にしました。
株化細胞、初代細胞を含む幅広い細胞への幅広いウイルス導入に使用できるViro-MICSTと、幹細胞へのレンチウイルス導入に最適化されたViro-MICST Stemがあります。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。
※ 本製品は単独では使用できません。Miltenyi社のMACS® column、Magnetic separatorおよび抗体標識Magnetic microbeadsを別途ご用意下さい。
※ MACS®はMiltenyi社の登録商標です。


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MACS®テクノロジーについて

■ 細胞分離の原理

MACS® columnには、強磁性体スフィアが充填してあります。このMACS® columnをMagnetic separatorにセットすると、スフィアが磁場を10,000倍に増幅し、カラム中の磁場の勾配が高くなります。これにより、Magnetic microbeadsで標識された細胞のみが分離されます。分離された細胞には、他の抗体を用いて免疫染色するのに十分なエピトープが残されています。カラム内のスフィア間には、一般的な細胞の数倍ほどの大きさの間隙があり、細胞はカラム内を自由に通過することができます。Magnetic microbeadsで標識された細胞は、カラム内で浮遊状態で存在するため、スフィアとは直接結合しません。これにより、細胞へのストレスが最小限に抑えることができます。また細胞が凝集するのを回避し、効率よく細胞を洗浄することができます。

■ MACS® microbeads

MACS® microbeadsは、50 nmの超常磁性体粒子で、細胞表面の抗原に対する特定の抗体と高度に結合します。50 nmという小さな形状のために、細胞を活性化しません。他の粒子とは異なり、MACS® microbeadsは常にコロイド状の浮遊状態で存在しているため、細胞との結合や標識を素早く行うことができます。MACS® microbeadsは細胞毒性がなく、生分解性があります。細胞を分離した後に行う他のアッセイにおいて、MACS® microbeadsを取り除く必要がありません。


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特長


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Viro-MICSTを用いたウイルス感染の原理


>Viro-MICSTを用いたウイルス感染の原理

目的細胞に特異的な抗体で標識されたMagnetic microbeadsを結合させる。Viro-MICSTを結合させたウイルス粒子と、Magnetic microbeadsを結合させた細胞を、MACS® column中でインキュベートすることで、目的細胞が分離され、同時にウイルスと細胞が会合することにより、ウイルスが細胞に感染します。


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操作方法概略


Viro-MICSTの操作法概略

  1. Viro-MICST：ウイルス粒子とViro-MICSTをピペッティングにより混合し、血清フリーの培地を加えた後、室温で20分インキュベートする。
    Viro-MICST Stem：Reagent STとReagent VMを混合して調製したWorking solutionにウイルス粒子を加えた後、室温で25分インキュベートする。
  2. MACS® cell separation columnにウイルス粒子をアプライし、カラム中のマトリックス（スフィア）に十分拡散させた後、カラムをMagnetic separatorにセットする。
  3. カラムにMagnetic microbeadsを結合させた目的細胞をアプライし、カラム中のマトリックスに十分拡散させた後、培地で洗浄し、室温で30分インキュベートする。
    ※ 試料細胞中に含まれる目的細胞の割合が低い場合や、必要とする純度が高い場合は、あらかじめ別のMACS® cell separation columnで前濃縮を行って下さい。
  4. カラムをMagnet separatorから外し、細胞をカラムから流出させる。

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Viro-MICSTの推奨使用量

MACS column
サイズ		磁気粒子で
標識した細胞数		感染ウイルス
粒子数		Viro-MICST
使用量
MS1×1061×10610 μl
LS2.5×1062.5×10625 μl
XS1×1071×107100 μl

※ 特定のMOI値を設定したい場合は、血清フリー培地やHBSやPBSといった塩を含むバッファーで希釈して下さい。


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Viro-MICSTで使用実績のある細胞とウイルスの種類

初代細胞細胞のタイプ由　来
hUC-MSCs臍帯間充織幹細胞ヒト
hCB-HSCs臍帯血造血幹細胞ヒト
Sca-1+ / LSKSca-1+造血幹細胞マウス
hPBMC末梢血単核球ヒト
CD4+、CD8+Tリンパ球マカクザル
細胞株細胞のタイプ由　来
293、HEK293、293-T、293-EBNAヒト胎児腎臓細胞ヒト
CHOチャイニーズハムスター卵巣細胞ハムスター
HMEC-1微小血管内皮細胞株ヒト
Jurkat、CEMx174、H9Tリンパ球ヒト
K562慢性骨髄性白血病細胞株ヒト
KOPNPh1陽性白血病細胞株ヒト
RAW 264.7マクロファージヒト
U937白血病性単球リンパ腫ヒト

ウイルスのタイプウイルス名
アデノウイルス／アデノ随伴ウイルスAd5-LacZ/-GFP、Ad5-PEG
レンチウイルス／レトロウイルスHIV、SIV、MuLV、MLV、FIV
ヘルペスウイルスHSV-I
アルファウイルスSindbis virus
ラブドウイルスVSV
ポリオーマウイルスSV40
パラミクソウイルスMeasles

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Viro-MICSTの使用例

ユーザーレビュー

“Magselectofection: an integrated method of nanomagnetic separation and genetic modification of target cells.”
Sanchez-Antequera, Y., et al,. Blood, 117 (16), e171 (2011). [PMID:21357765]
以下のViro-MICST使用例はすべて本文献からの引用となります。

目的細胞への高効率かつ特異的なウイルス導入

目的細胞への高効率かつ特異的なウイルス導入

0.5×106 cellsずつのJurkat T細胞とK562細胞の混合液に、抗CD2抗体標識microbeadsを反応させた後、1つめのMACS® LS columnで前濃縮を行った。次いで、eGFP発現レンチウイルス／Viro-MICST複合体（MOI 0.5、6.5 μl Viro-MICST）を結合させた2つめのMACS® LS columnに、前濃縮した細胞溶液をアプライした。
CD2－細胞画分（K562細胞）とポジティブセレクションされたCD2＋細胞画分（Jurkat T細胞）それぞれについて、図中に記載の経過日数後にGFP発現を解析したところ、Jurkat T細胞に特異的かつ高効率にウイルス導入されていることが示された。


さまざまな血球細胞へのレンチウイルス導入

さまざまな血球細胞へのレンチウイルス導入

ヒト全血から単離したPBMC（末梢血単核細胞）に、抗CD45抗体、抗CD2抗体、抗CD15抗体のいずれかで標識したmicrobeadsを反応させた。その後、eGFP発現レンチウイルスをそれぞれの方法で導入した。
Standard Infection：未修飾のMACS® LS columnで細胞選択後、MOI 0.5で通常のウイルス導入を行った。
Viro-MICST：1つめのMACS® LS column（未修飾）で前濃縮を行った。次いで、106 VPのレンチウイルスに6.5 μlのViro-MICSTを加え、MOI 0.5で結合させた2つめのMACS® LS columnに、前濃縮した細胞溶液をアプライした。
感染効率はフロ―サイトメトリーで解析した。それぞれのCDマーカーが発現している血球細胞において、Viro-MICSTによる特異的かつ高効率なウイルス導入が示された。


ヒト臍帯間充織幹細胞へのアデノウイルス導入

ヒト臍帯間充織幹細胞へのアデノウイルス導入効率
ヒト臍帯間充織幹細胞へのアデノウイルス導入写真

ヒト臍帯間充織幹細胞（hUC-MSC）に、標準的なアデノウイルス導入法およびViro-MICSTを用いて、図中に記載のMOIでアデノウイルスを導入した。
Viro-MICSTを用いた手法は、1×106 cellsのhUC-MSCに抗CD105抗体標識microbeadsを反応させた後、eGFP発現アデノウイルス／Viro-MICST複合体（106 VPのウイルスに3 μl Viro-MICSTを添加）を結合させたMACS® LS columnに、細胞をアプライした。
導入効率は、感染3日後にフローサイトメトリーで解析した。
写真は、それぞれの手法でMOI 2で導入2日後のもの。


Viro-MICSTでレンチウイルス導入したヒト臍帯間充織幹細胞の分化能維持について

Viro-MICSTでレンチウイルス導入したヒト臍帯間充織幹細胞の分化能維持について

ヒト臍帯間充織幹細胞（hUC-MSC）に抗CD105抗体標識microbeadsを反応させた後、eGFP発現レンチウイルス／Viro-MICST複合体（106 VPのウイルスに10 μl Viro-MICSTを添加、MOIは図中に記載）を結合させたMACS® LS columnに、細胞をアプライした。
ウイルス導入2日後に骨形成培地を用いて細胞を刺激し（写真上段）、細胞刺激18日後（ウイルス導入20日後）にアリザリンレッド染色を用いて細胞を解析した。


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Viro-MICST Stemの使用例

CD34陽性細胞へのレンチウイルス導入

CD34陽性細胞へのレンチウイルス導入効率
CD34陽性細胞へのレンチウイルス導入の蛍光顕微鏡写真

KG1a細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来、CD34＋、造血幹細胞の代用）に、抗CD抗体標識microbeadsを反応させた後、MACS® columnにアプライした。レンチウイルス単独（図中：NT）、またはレンチウイルス／Viro-MICST Stem複合体（図中：Viro-MICST Stem）を併せてアプライし、カラムをMagnetic Separatorにセットして室温で30分間インキュベートした。その後、溶出した細胞を72時間インキュベートし、GFPをフローサイトメーターおよび蛍光顕微鏡で測定したところ、CD34陽性細胞におけるレンチウイルス導入促進が示された。
A：GFP陽性細胞の割合、B：平均蛍光強度、C：蛍光顕微鏡像


Viro-MICST Stemでレンチウイルス導入したCD34陽性細胞の細胞生存率について

レンチウイルス導入したCD34陽性細胞の細胞生存

KG1a細胞（ヒト急性骨髄性白血病由来、CD34＋、造血幹細胞の代用）に、MACS® columnを用いてレンチウイルス（HIV-SFFV-GFP）／Viro-MICST Stem複合体（図中：VM Stem）をMOI 5で導入した。72時間後、非浸透性のDRAQ7による核染色を用いて後期アポトーシスを測定し、GFP＋細胞（図中：棒）とDRAQ7＋細胞（図中：青丸）の割合をフローサイトメトリーで測定した。
ViroMICST Stemは、導入後に細胞毒性を誘発しないことが示された。


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キット内容

Viro-MICST

  • Viro-MICST reagent

Viro-MICST Stem

  • Reagent ST
  • Reagent VM

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Viro-MICST

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Viro-MICSTが結合したウイルス粒子と、特異的抗体により磁気ビーズ標識した目的細胞を同時に磁性カラムにアプライすることにより、目的細胞の分離濃縮とウイルス導入を同時に行える。幅広い種類の細胞用。25～50アッセイ分（細胞数1×106，MOI＝1）。
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（テクニカルサポート 試薬担当）

reagent@funakoshi.co.jp

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