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ご要望に適した発現系を選択することができます 組換えタンパク質の受託発現・精製サービス

掲載日情報:2018/09/12 現在Webページ番号:4429

組換えタンパク質の受託発現・精製サービスです。組換えタンパク質発現系には,それぞれ一長一短があり,1種類の発現系のみでは,あらゆるタンパク質を産生することは困難です。
株式会社プロテイン・エクスプレスでは多岐な発現系を取り揃えており,お客様のご要望に適した発現系を選択することができます。精製工程においても,アフィニティ精製だけでなく,イオン交換カラム精製やサイズ排除クロマトグラフィなどにも対応いたします。
コンストラクトの設計から産生及び精製までのトータルコンサルティングを行い,お客様のご要望に最大限対応できる柔軟なサービスを提供いたします。

組換えタンパク質発現受託サービス

発現系の種類


発現系 特 長
大腸菌
E. coli
  • 多様な宿主・ベクター系が市販されており,様々なターゲットに適応できる。
  • 高発現のため安価に産生が可能。
  • 封入体を形成することがある。
ブレビバチルス菌
Brevibacillus choshinensis1, 2, 3
  • タンパク質を培地中に分泌することが可能。
  • 分泌タンパク質を正しい構造で産生できる。
  • 菌体外プロテアーゼが少ないので,培養中の分解が生じない。
  • グラム陽性菌のため,エンドトキシンがない。
哺乳動物細胞
(HEK293, COS-7 等)
  • 活性型の構造を有するタンパク質が取得しやすい。
  • 糖鎖などの翻訳後修飾が可能。
無細胞翻訳系
(大腸菌, 小麦胚芽, 昆虫細胞)4, 5
  • 毒性を持つなど細胞内で生産できないタンパク質の生産が可能。
  • 界面活性剤などの各種添加剤存在下での生産が可能。
  • 直鎖の鋳型を使用できるので,ハイスループットでの発現確認を行える。

発現系の比較


発現系 発現量 初期費用 後期費用 糖鎖修飾 S-S 結合
E. coli × ×
ブレビバチルス菌 ×
哺乳動物細胞
無細胞翻訳系 ×

S-S 結合はリフォールディングで対応できる場合があります。
E. coli発現系については,ジャーファーメンターを用いた培養により,培養中のpHなどの制御や流加培養にも対応いたします。また,GMP対応の提携先での100 L~の培養にも対応いたします。


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組換えタンパク質精製受託サービス

対応可能な精製工程

  • アフィニティクロマトグラフィ(Hisタグ,GSTタグ,MBPタグ)
  • プロテインA,プロテインGによる抗体精製
  • イオン交換クロマトグラフィ
  • 疎水クロマトグラフィ
  • サイズ排除(ゲルろ過)クロマトグラフィ
  • 塩析,膜分画(濃縮,脱塩)

ハイブリドーマ培養上清からの抗体精製,宿主細胞養上清からの組換え抗体精製のいずれにも対応いたします。

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受託作業の流れ

  1. 作業内容の協議(秘密保持契約書の締結)
  2. 発現ベクターの構築(融合タンパク質,変異導入)
  3. 発現トライアル(条件検討,発現量の見積)
  4. スケールアップ産生(2. の結果より産生スケールを決定)
  5. 精製(アフィニティ,イオン交換,ゲルろ過)
  6. リフォールディング(オプション)

精製からのご依頼といった部分的な作業にも対応いたします。

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技術情報

技術情報(1):E. coliによるタンパク質生産のモデルケースでの実施例

E. coliによるタンパク質生産に関して,一般的なフローをモデルケースとして実施した。

【試験1:小規模発現試験・精製トライアル】
あるタンパク質をコードする発現ベクターを3種のE. coli株に導入,2種の誘導条件で発現誘導を行った。菌体を回収,超音波破砕を行った後に,Niキレートカラムを用いた簡易精製試験を実施した。
図中,目的タンパク質のバンドを赤矢印で示した。宿主や誘導条件により生産量,可溶性での生産割合等が異なっており,発現させたい対象により,生産系の選択が重要であると言える。

小規模発現

各条件における目的タンパク質の確認(小規模発現試験)と精製トライアル


【試験2:スケールアップ培養,Niキレートカラム精製】
試験1で得られた最適条件でスケールアップ培養を行い,菌体破砕後の可溶性画分をNiキレートカラムにアプライした。カラムをバッファーで洗浄後,イミダゾールの濃度勾配により目的タンパク質を溶出させたところ,図中の赤線で囲ったフラクションに目的タンパク質が溶出されていることを確認し,これらのフラクションを回収した。

Niキレートカラム精製

Niキレートカラム精製のクロマトチャートとSDS-PAGE解析

【試験3:ゲルろ過カラム精製】
一般にNiキレートカラム精製では非特異的な結合により,夾雑タンパク質が混入することが見られるため,さらなる高純度化を目的としてゲルろ過カラム精製を行った。その結果,目的タンパク質の高分子側に見られた夾雑タンパク質との分画ができ,より高純度のタンパク質標品が得られた。

ゲルろ過カラム精製

ゲルろ過カラム精製のクロマトチャートとSDS-PAGE解析

【まとめ】
各工程の標品をSDS-PAGEにて解析,目的タンパク質をバンド強度から純度測定した。ゲルろ過カラム精製まで実施することで,最終的に95%という高純度のタンパク質標品を得ることができた。

SDS-PAGEにて解析

今回の結果はモデルケースとして実施したもので,すべての対象で本結果が反映されるわけではありません。株式会社プロテイン・エクスプレスでは,Niキレートカラム精製などのアフィニティカラムだけでなく,イオン交換,ゲルろ過カラム精製などにも対応しており,お客様のご要望に応じた精製工程のご提案を行うことができます。


技術情報(2):E. coliのフラスコ培養と流加培養の生産性比較

【試験:タンパク質発現試験】
あるタンパク質をコードする発現ベクターをE. coli株に導入,ジャーファーメンターを用いた流加培養と,2種の培地(LB培地,TB培地)で通常のフラスコ培養を行い,タンパク質の生産性を比較した。
その結果,流加培養では培養スケール当たりの生産性が,LB培地でフラスコ培養したときと比べて13倍,TB培地でフラスコ培養したときと比べて5倍程度高くなった。
ODと生産量の比率がほぼ同じことから,菌体量の増加がそのままタンパク質の生産量の向上に繋がっていると思われる。

流加培養との生産性比較

各培養方法によるタンパク質生産性

技術情報(3):動物細胞での蛍光タンパク質発現例


哺乳動物発現

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参考文献

  1. Tojo, H., et al., J. Biotechnol., 33, 55-62 (1994).
  2. Takimura, Y., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1858-1861 (1997).
  3. Yashiro, K., et al., Protein Expr. Purifi., 23, 113-120 (2001).
  4. Seki, E., et al., Anal. Biochem., 377, 156-161 (2008).
  5. Aoki, M., et al., Protein Expr. Purifi., 68, 128-136 (2009).


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ご注文方法/価格

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