土壌からの高純度ゲノムDNA抽出キット E. Z. N. A. Soil DNA Kit

土壌中のDNAを分子レベルで解析することは、土壌中に存在するバクテリアを検出し、バクテリアの多様性を研究するための直接的な解決策となります。しかし、土壌からのDNA抽出は、フミン酸のようなDNA抽出プロセスを阻害し、かつ下流のアプリケーションを妨げる物質が多く含まれているため困難な場合が多くなります。理想的なDNA抽出法は、阻害物質を効果的に除去し、DNA収量を最大化するものでなければなりません。本アプリケーションノートの主たる目的は、Omega Bio-tek社のE.Z.N.A. Soil DNA Kit（#D5625）とA社のSoil DNA Isolation Kitの性能を、DNAの収量と品質の点で比較し、さらにリアルタイムPCRを用いた検出により、増幅能力と感度の点で比較することです。

200 mgの土壌に10 μlのZymoBIOMICS Microbial Community Standard（ZymoResearch社）を添加した試料から、E.Z.N.A. Soil DNA Kit（Omega Bio-tek社）と DNA Isolation Kit（A社）各キットの推奨プロトコルによりDNAを抽出した。ZymoBIOMICS Microbial Community Standardは、10種類の微生物（易溶解性のグラム陰性菌3種類、難溶解性のグラム陽性菌5種類、難溶解性の酵母2種類）で構成されており、2つのキットの性能を比較する際のベンチマークとなる。

土壌試料はビーズ式細胞破砕装置Omni Bead Ruptor 24（Omni International社）を用いてホモジナイズし、それぞれのキットのメーカー推奨プロトコルに従って分離を行った（三重試験）。操作時間は、A社キットの抽出が約60分、Omega Bio-tek社キットの抽出が約70分であり、使い勝手は同等だった。

精製されたDNAは、各キットに付属した溶出バッファー100μlで溶出し、QuantiFluor dsDNA System（Promega社）を用いて定量した。両キットから得られた精製DNAの品質は、精製DNAの10倍、100倍、1,000倍希釈液について、バクテリア16S rRNA遺伝子特異的プライマーを用いたリアルタイムPCRで分析した。さらに、Listeria monocytogenes（グラム陽性菌）とSaccharomyces cerevisiae（酵母）の2つの難溶解性の微生物について、Listeria特異的プライマーまたはSaccharomyces特異的プライマーを用いて、10倍および100倍希釈液中の相対的な存在量を調べた。具体的には、BrilliantⅢ 2× SYBR（Agilent Technologies社）をマスターミックスとして使用し、ABI 7900の標準プロトコルに従い、標的遺伝子に対するプライマー、適切に希釈したテンプレートDNA 2 μlを使用して、総容量20μlの反応系でqPCRをセットアップした。

ZymoBIOMICS Microbial Community Standardを添加した土壌試料から、Omega Bio-tek社キットとA社キットを用いてそれぞれ得られたDNAの収量を図3に示す。Omega Bio-tek社キットの性能はA社のキットに比べて有意に優れており、100μlの最終容量で溶出した場合、収量が40%増加した（8.1μg vs. 5.7μg）（p < 0.05；テューキーの post-hoc analysisによる）。

各抽出液から得られたDNAの品質は、qPCRで得られたCt（Threshold Cycle）値に基づいて判定した。表2は、連続希釈した精製DNAを試料として、バクテリア16S rRNA遺伝子特異的プライマーを用いたqPCRで得られた平均Ct値を示している。Omega Bio-tek社キットで得られた精製DNAでは、Ct値がわずかに小さく（～0.5）なった。

表2. 連続希釈した精製DNAを試料として、バクテリア16S rRNA遺伝子特異的プライマーを用いたqPCRで得られた平均Ct値

図4は、10倍および100倍に希釈した精製DNAをテンプレートとして、ListeriaおよびSaccharomyces特異的プライマーを用いてPCRを行った際に得られた平均Ct値を示す。Listeria monocytogenesおよびSaccharomyces cerevisiaeは、いずれも難溶解性であるが、Omega Bio-tek社キットのCt値がA社のCt値よりも有意に小さいことを示す結果となった（p<0.05；テューキーの post-hoc analysisによる）。
グラム陽性菌であるListeriaでのCt値は1サイクル小さく、酵母SaccharomycesのCt値はほぼ3サイクル小さかった。つまり、A社キットと比較して、Omega Bio-tek社キットはListeriaとSaccharomycesからの収量がそれぞれ2倍および8倍高かった。段階希釈した試料間のΔCtは、両キットとも同程度であった（Listeriaでは～3.1、Saccharomycesでは～3.4）。

これらのデータは、Omega Bio-tek社のキットが、精製DNAからPCR阻害物質を除去する点ではA社キットと同様に優れた性能を有し、収率では勝っていることを示している。qPCRで得られたCt値は、得られた収量と一致しており、Omega Bio-tek社のE.Z.N.A. Soil DNA KitはA社製品よりも優位であった。

Omega Bio-tek社のキットは、A社キットと比べて有意に高い収率で土壌試料からDNAを抽出することができ、難溶解性のバクテリアの場合でも同様に高性能を示した。Omega Bio-tek社キットは、PCR阻害物質を効果的に除去できた。これは、Omega Bio-tek社キットが分離したDNAが、A社キットによるDNAよりも一貫して早く増幅され、Ct値も小さいことで示される。

さらにCt値が小さいことは、Omega Bio-tek社キットを用いて得られたDNAの品質が高いことを示している。以上の結果から、Omega Bio-tek 社のE.Z.N.A. Soil DNA Kitは、qPCRや次世代シークエンシングなどの様々な下流のアプリケーションに対応した、高収量・高品質のDNAを抽出できるキットであることが示された。