銀増感試薬キット Silver Enhancement Kit HQ Silver, LI Silver

一般的な注意事項

1. 銀増感反応前に、すべての試料が超純水または脱イオン水で完全に洗浄されていることを確認して下さい。ハロゲン化物または他の銀の沈殿物を生じさせる陰イオンは沈殿物を形成し、それ自体がEMで視覚化され、さらなるバックグラウンド染色の核となります。
2. 銀増感反応前にキレート剤で試料を洗浄します。通常、銀増感試薬の添加前の最後の洗浄として、ブロットにEDTA二ナトリウム（0.05 M、pH 4.6）を使用します。
3. 少なくとも20～30分間、Farmer溶液（10％チオ硫酸ナトリウム：10％フェリシアン化カリウム＝9：1）でガラス器具（試薬の混合、標本の取り扱い、または銀エンハンサーの保管用）を洗浄します。
4. 試料の取り扱いには、プラスチック製またはテフロン加工（非金属製）のピンセットと器具を使用して下さい。

• a：銀増感反応の前と最中に実験条件を変更します。
• b：銀増感反応の「増感反応の停止条件」を改善するか、増感反応の停止後に現像します。

反応中のバックグラウンドの低減

反応およびバックグラウンド反応の停止

• 1％酢酸
• 1％酢酸の後、写真現像定着剤（Agefix、Agfa-Gevaert、または Ilfospeed 200、Ilford）
• これらを使用して、直接写真を修正する。
• 2.5％塩化ナトリウム溶液で軽く洗浄する。
• 1％酢酸、酢酸バッファー中で洗浄し、0.05％HAuCl₄で3～10分間調色する。3％チオ硫酸ナトリウム溶液で除去する。ポリアクリルアミドゲル上で実行されたNanogold標識タンパク質は、水で停止した場合とは対照的に、10% グルコースを含む10％酢酸水溶液で増感反応を停止した場合、低バックグラウンドを維持することが示されています^2-3。

参考文献

• 2-1：Powell, R.D., et al., "A covalent fluorescent-gold immunoprobe: simultaneous detection of a pre-mRNA splicing factor by light and electron microscopy.", J. Histochem. Cytochem., 45(7), 947～956 (1997). [PMID：9212820]
• 2-2：Safer, D., et al., "Undecagold clusters for site-specific labeling of biological macromolecules: simplified preparation and model applications.", J. Inorg. Biochem., 26(2), 77～91 (1986). [PMID：3958709]
• 2-3：Hainfeld, J. F., and Powell, R. D., "Nanogold Technology: New Frontiers in Gold Labeling.", Cell Vision, 4, 408～432 (1997).
• 2-4：Danscher, G., "Histochemical demonstration of heavy metals. A revised version of the sulphide silver method suitable for both light and electronmicroscopy.", Histochemistry, 71(1), 1～16 (1981). [PMID：6785259]
• 2-5：Immunogold-Silver Staining：Principles, Methods and Applications., M. A. Hayat (Ed.), CRC Press, Boca Raton, pp. 6～8 (1995).

四酸化オスミウム濃度を下げる方法

金調色による粒子損失の防止

❶ Araiらの方法：Diana Van Driel（シドニー大学眼科、オーストラリア（2006））^4-2～4-3

1. 銀増感反応後、脱イオン水で十分に洗浄する。
2. 0.05％塩化金で10分間（4℃）洗浄する。
3. 脱イオン水で洗浄する。
4. 0.5％シュウ酸: 室温で 2分間洗浄する。
5. 1％チオ硫酸ナトリウム（用事調整）で1時間洗浄する。
6. 脱イオン水で十分に洗浄し、通常の手順に従って包埋する。

❷ Sawadaらの方法^4-4

1. 蒸留水で素早く2回洗浄する。
2. 0.05 M酢酸ナトリウムで、再度1分間、素早く洗浄する。
3. 0.05 %テトラクロロ金酸で2分洗浄する。
4. 0.5％シュウ酸: 室温で 2分間洗浄する。
5. 蒸留水で10分間十分に洗浄後、浸透させます。

参考文献

• 4-1：Burry, R.W., "Pre-embedding immunocytochemistry with silver-enhanced small gold particles.", Immunogold silver staining：Principles, methods and applications, M.A. Hayat (Ed.)., CRC Press, Boca Raton, p.217～230 (1995).
• 4-2：Arai, R., et al., "Intensification of labelings of the immunogold silver staining method by gold toning.", Brain Res. Bull., 28(2), 343～345 (1992). [PMID：1375863]
• 4-3：Arai, R., and Nagatsu, I., Immunogold-Silver Staining：Principles, Methods and Applications., M. A. Hayat (Ed.), CRC Press, Boca Raton., p.209～216 (1995).
• 4-4：Sawada, H. and Esaki, M., "Use of nanogold followed by silver enhancement and gold toning for preembedding immunolocalization in osmium-fixed, Epon-embedded tissues.", J. Elect. Microsc.(Tokyo), 43(6), 361～366 (1994). [PMID：7722428]

参考文献

• 6-1：Li, H., et al., "Localization of a metabotropic glutamate receptor, mGluR7, in axon terminals of presumed nociceptive, primary afferent fibers in the superficial layers of the spinal dorsal horn: an electron microscope study in the rat.", Neuroscience Lett., 223(3), 153～156 (1997). [PMID：9080455]
• 6-2：Salas, P.J., "Insoluble gamma-tubulin-containing structures are anchored to the apical network of intermediate filaments in polarized CACO-2 epithelial cells.", J. Cell Biol., 146(3), 645～657 (1999). [PMID：10444072]

• HQ SilverまたはLI Silverの代りに、銀増感試薬のDanscher^7-1を使用して下さい。
• 固定に使用するグルタルアルデヒド量を可能な限り減らします。パラホルムアルデヒド量は、それに応じて増加する可能性があります。

参考文献

• 7-1：Danscher, G., "Localization of gold in biological tissue. A photochemical method for light and electronmicroscopy.", Histochemistry, 71(1), 81～88 (1981). [PMID：6785260]