Abnova 社推奨標準プロトコル 免疫組織染色標準プロトコル [参考資料]

• 抗原の賦活化処理
• パラフィン包埋切片染色法
• 試薬
• 関連試薬

抗原の賦活化処理

以下のいずれか１つの方法あるいはお客様の方法により試料を前処理して下さい。

• 前処理なし。
• 試料を 1 ×クエン酸バッファー（pH 6.0）に入れて、電子レンジで 750 W、20 分間加熱処理した後に試料を冷却します。
• 試料を 1 × Tris/EDTA バッファー（pH 9.0）に入れて、電子レンジで 750 W、20 分間加熱処理した後に試料を冷却します。
• 試料を HCl（2N）（pH 0.6 〜 0.9）に入れて、室温で 10 〜 20 分間放置します。
• 試料を 0.1% トリプシン溶液に入れて、37℃で 25 分間振とうします。

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パラフィン包埋切片染色法

1. 組織切片をキシレンまたはその他の脱パラフィン試薬で脱パラフィン処理した後、段階的な濃度のアルコール溶液で水和します。
2. 蒸留水で 5 分間洗浄します。
3. 内在性ペルオキシダーゼ活性を除去する必要がある場合は、0.3％過酸化水素−メタノール（または蒸留水）溶液に浸し、30 分間反応させます。過酸化水素の濃度を上げれば、反応時間を短縮することができます。
   ※内在性ペルオキシダーゼ活性が問題とならない場合は、このステップは省略しても構いません。
4. PBS（10 mM Na₂HPO₄（pH7.5）-0.9% Saline）で 5 分間洗浄します。
5. 調製済み（2.5％）ブロッキング用ウマ正常血清またはブロッキング試薬を滴下し、20 分間反応させます。
6. 適切なバッファーで希釈したマウスモノクローナル抗体（一次抗体）を滴下し、4℃で 1 晩反応させます（希釈倍率については各製品のデータシートをご参照下さい）。
7. PBS で 5 分間洗浄します。
8. Vector Laboratories 社 ImmPRESS Reagent（VEC 社 #MP-7402）を滴下し、30 分間反応させます。
9. PBS で 5 分間洗浄します。
10. DAB 基質溶液を滴下し、適切な染色強度が得られるまで（通常 2 〜 10 分間）反応させます。
    DAB 基質溶液調製方法
    蒸留水 5.0 ml にVector Laboratories 社 DAB Substrate Kit（VEC 社 #SK-4100）中の Buffer stock solution（B 液）を 2 滴加えてよく混ぜます。次に DAB stock solution（ A 液）を 4 滴加えてよく混ぜ、最後に過酸化水素（ C 液）を 2 滴加えてよく混ぜて DAB 基質溶液を調製します。黒灰色に染色したい場合は、更にニッケル溶液（ D 液）を 2 滴加えてよく混ぜます。ニッケル溶液を加えると色調が変わるだけでなく、染色感度も上がります。
11. 蒸留水で洗浄します。
12. 対比染色後（Vector Laboratories 社 Hematoxylin, VECTOR（#H-3401）、Methyl Green, VECTOR（#H-3402）または Hematoxylin QS, VECTOR（#H-3404）等が利用できます）、脱水、透徹処理し、非水溶性の封入剤（Vector Laboratories 社 VectaMount Permanent Mounting Medium, #H-5000）などで封入します。

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試薬

• ImmPRESS Reagent, Anti-Mouse Ig（VEC 社 #MP-7402）
• DAB Substrate Kit（VEC 社 #SK-4100）
• クエン酸バッファー, pH6.0: 10 mM クエン酸ナトリウムバッファー
• 1 × Tris/EDTA pH9.0、10 mM Tris base, 1 mM EDTA 溶液, 0.05% Tween20
• 2N HCl 溶液, pH0.6 〜 0.9
• PBS（10 mM Na₂HPO₄（pH7.5）-0.9% Saline）

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関連試薬

• Vector Laboratories 社 Hematoxylin, VECTOR（VEC 社 #H-3401）
• Vector Laboratories 社 Methyl Green, VECTOR（VEC 社 #H-3402）
• Vector Laboratories 社 Hematoxin QS, VECTOR（VEC 社 #H-3404）
• Vector Laboratories 社 VectaMount Permanent Mounting Medium（VEC 社 #H-5000）
• Lab Vision 社 Citrate Buffer, 10 × , for Heat-Induced Epitope Retrieval（LVC 社 #TA-500-CB）
• Lab Vision 社 EDTA Buffer for Heat-Induced Epitope Retrieval（LVC 社 #AP-9004）

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