Abnova 社推奨標準プロトコル Capture ELISA 標準プロトコル[参考資料]

• 実験手順
• 試薬

実験手順

1. プレートの各ウェルに抗体濃度が 10 μg/ml となるようにコーティングバッファーで調製した捕捉用抗体を 100 μl 加えます。
2. プレートを 4 ℃で 1 晩インキュベートします。
3. 各ウェルに 250 μl のブロッキング溶液を加えます。
4. プレートを室温で 1 時間インキュベートします。
5. プレート各ウェルを PBST（0.05% Tween-20）で 1 回洗浄します。
6. スタンダード（recombinant protein with GST）を 100 ng, 30 ng, 10 ng, 3 ng, 1 ng,0.3 ng, 0.1 ng, 0.03 ng/ml に希釈します。
7. 各濃度のスタンダード、および測定用試料を各ウェルに加えます。
8. プレートを室温で 2 時間インキュベートします。
9. プレートを空にし、PBST（0.05% Tween-20）で 3 回洗浄します。
10. ウサギ抗 GST 抗体（1 μg/ml）を各ウェルに加えます。（100 μl/well）
11. プレートを室温で 2 時間インキュベートします。
12. プレートを空にし、PBST（0.05% Tween-20）で 3 回洗浄します。
13. 各ウェルに二次抗体として HRP 標識ヤギ抗ウサギ IgG（H ＋ L）抗体を加えます。
14. プレートを室温で 1 時間インキュベートします。
15. プレートを空にし、PBST（0.05% Tween-20）で 5 回洗浄します。
16. 各ウェルに 150 μl の酵素基質溶液（OPD, 400 μg/ml, 0.03% H₂O₂、クエン酸バッファー）を加えます。
17. 室温で 30 分インキュベートします。
18. 450 nm での吸光度を測定します。

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試薬

• コーティングバッファー：PBS（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄）
• ブロッキング溶液：5% スキムミルクPBST（0.05% Tween-20）溶液
• 希釈液：2% スキムミルクPBST（0.02% Tween-20）溶液
• クエン酸バッファー：3.65 g クエン酸、4.76 g Na₂HPO₄, 500 ml 蒸留水

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