Abnova 社推奨標準プロトコル ウエスタンブロッティング標準プロトコル[参考資料]

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• ウエスタンブロッティング
• 装置
• 試薬
• 関連試薬

SDS-PAGE

アクリルアミド濃度（％）	分子量（kDa）
15	10 〜 43
12	12 〜 60
10	20 〜 80
8	36 〜 94
6	57 〜 212

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ウエスタンブロッティング

1. 適量のブロッキングバッファ−（5% スキムミルク／ PBST（0.2%））を加えて室温で 1 時間振とう、あるいは 4 ℃で一晩静置します。もしメンブレンをすぐに使用しない場合は -20℃で保存し 1 週間以内に使用して下さい。
2. 表2 を参照し、一次抗体を新しく調製したブロッキングバッファーで適正な濃度に希釈します。ブロッキングバッファーからメンブレンを取り出し、希釈した一次抗体をメンブレンに加えて 4 ℃で 1 晩振とうします。
3. 十分な量の PBST（0.2%）で 10 分間メンブレンを洗浄します。これを 3 回繰り返します。
4. 表2 を参照し、希釈した二次抗体（HRP-goat anti-mouse IgG）を適量加えます。その後メンブレンを室温で 1 時間振とうします。
5. メンブレンを PBST（0.2%）で10 分間洗浄します。これを 4 回繰り返します。
6. メンブレン洗浄後に、ラップ上に置き、新しく調製した検出試薬（Pierce 社 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, PCC 社 #34094/#34095/#34096）をメンブレン全体に均一になるように加えて 5 分間静置します。
• Pierce 社 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（PCC 社 #34094/#34095/#34096）
  付属の SuperSignal West Femto Luminol/Enhancer Solution と SuperSignal West Femto Stable Peroxidase Solution を使用直前に 1：1 の割合で褐色ビンに入れて混合し、基質溶液を調製します。混合液は過度の露光を避けて下さい。ただし、研究室での短時間の露光は影響ありません。この基質溶液をメンブレン全体に均一になるように加えて下さい（不均一な場合には、写真を撮った際にメンブレンの一部が過露光となります）。0.6 ml の基質溶液で 8 cm × 10 cm のメンブレンに使用できます（詳細については同製品のデータシートをご参照下さい）。
7. 余分な検出試薬を除去し、メンブレンをラップに包みます。この際気泡が入らないように注意して下さい。ブロット面を上側にして置き、速やかに CCD カメラで 5 秒後、20 秒後、1 分 30 秒後および 5 分後に撮影します。
8. シグナルが強すぎる場合には、二次抗体の濃度をさらに希釈して下さい。
9. ブロットしたメンブレンは再利用が可能です。リプローブする際は、Pierce 社 Restore Plus Western Blot Stripping Buff er（PCC 社 #46430）のご使用をお勧めします。

抗原のタイプ	抗原 （μg/lane）	一次抗体希釈率				二次抗体希釈率b
		ポリクローナル抗体	ハイブリドーマ上清	Ascites	精製lg
細胞／組織ライセート	25 〜 50	1：500 〜 1：1,000	原液〜 1：5	1：500 〜 1：1,000	1 〜 5（μg/ml）	1：2,500 〜 1：5,000
精製タンパク質	0.1 〜 0.2	1：1,000 〜 1：2,500	原液〜 1：5	1：500 〜 1：1,000	1 〜 5（μg/ml）	1：5,000 〜 1：10,000

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装置

• シェーカー
• Auto Chemi System

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試薬

• ブロッキングバッファー／希釈用バッファー（ 5% スキムミルク／ PBST（0.2%））：
  スキムミルク 5 gを 1 × PBST（0.2%）に溶解し 100 ml として下さい。
• 10 × PBS：
  NaCl 75.9 g とNaH₂PO₄・H₂O 13.8 g を蒸留水 800 ml に溶解した後に、NaOH を加えて pH7.0 に調製し、蒸留水を加えて 1,000 ml として下さい。使用時に蒸留水で 10 倍希釈し 1 × PBS を調製して下さい。
• PBST（0.2%）：
  1 × PBS 1,000 ml に Tween-20 を2 ml 加えて下さい。
• 二次抗体（4℃保存）：
  下記製品のご使用をお勧めします。
  • Abnova 社HRP Labeled Goat Anti-Mouse IgG（H ＋ L）、ヒト血清による吸収処理済（ABN 社#PAB0096）
  • KPL 社HRP Labeled Goat Anti-Mouse IgG（H ＋ L）、ヒト血清による吸収処理済（KPL 社#074-1806）
• 化学発光試薬：
  Pierce 社 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate（PCC 社 #34094/#34095/#34096）
  注意：化学発光試薬は随時調製して下さい。

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関連試薬

• Kirkegaard & Perry Laboratories 社 HRP Labeled Goat Anti-Mouse IgG（H ＋ L）、ヒト血清による吸収処理済（KPL 社 #074-1806）
• Pierce 社 Restore Plus Western Blot Stripping Buff er（PCC 社 #46430）

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