トランスポサジェン社 カスタムXTN TAL Nuclease作製サービスに関するFAQ

Q1. TAL Effectors NucleaseはどのようにDNAを切断するのですか。

A1. TAL Effectors Nucleaseは,植物病原菌Xanthomonas由来TALEs(Transcription Activator-Like Effectors)タンパク質の,高度に保存されたaa 33~35からなるDNA結合ドメインと,FokⅠのヌクレアーゼドメインを融合したハイブリッド酵素です。DNA結合ドメインの組み合わせにより,新規の標的DNA配列を認識することができます。

TAL Effectors Nucleaseのヘテロダイマーは,二本鎖DNAのフォワード鎖,リバース鎖それぞれの認識配列に結合し,標的DNA配列を切断することができます。

標的DNAが切断されると,細胞内で非相同末端再結合(Non-Homologous End Joining:NHEJ)やhomology-directed repairによる修復が生じるため,サイズの異なる配列の欠損や挿入が可能となります。

Q2. DNAのどの部位を切断すべきかを調べるには,どうすればよいですか。

A2. 目的の実験用途によって異なりますが,一般的には,DNAの配列をBLAST解析することで,調べることができます。TAL Effectors Nucleaseを用いてノックダウンを行うのであれば,目的遺伝子の開始コドンから通常50~100塩基に位置する第一エキソンを切断するように設計して下さい。また,リピート配列部分は避けて下さい。但し,この方法は,目的遺伝子を完全にノックダウンさせることを保証するものではありません。ご依頼前に,必ずバイオインフォマティクス解析を行ってください。

Q3. 納品されたカスタムXTN TAL Nuclease発現ベクターから,TAL Effectors NucleaseのRNAを作製することができますか。

A3. できます。in vitro RNA合成のためのT7プロモーターが組み込まれているため,mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit(Life Technologies社)などのキットを用いて作製可能です。カスタムXTN TAL Nuclease発現ベクターは,BglⅡ,StuⅠ,AvrⅡなどで切断できます。

Q4. TAL Effectors Nucleaseはホモダイマー化させることができますか。

A4. Transposagen社のカスタムXTN TAL Nucleaseは,野生型FokⅠヌクレアーゼを用いており,ホモダイマーを形成することができます。長い認識配列(一般的に16~18塩基)を用いることにより,off-site cuttingなどのリスクを最小化します。

Q5. 納品されたカスタムXTN TAL Nuclease発現ベクターは,ただちに細胞に導入可能ですか。

A5. 可能です。カスタムXTN TAL Nuclease発現ベクターは,エンドトキシンフリーで,Ready-to-useです。

Q6. カスタムXTN TAL Nuclease発現ベクターを増やしたいとき,特別な方法が必要ですか。

A6. Transposagen社では,組換え不能細胞であるSTBL3などを用いて,カスタムXTN TAL NucleaseをコードするDNA中の繰り返し配列における組換えリスクを最小化することをお勧めしています。

Q7. DNAの標的配列決定のために,BLAST解析などの解析を行ってもらえますか。

A7. Transposagen社では解析は実施しておりません。必要な場合はお客様ご自身で行って下さい。

Q8. どのように細胞にトランスフェクションすれば良いですか。

A8. リポフェクションとエレクトロポレーションのいずれも適用できますが,細胞により適したトランスフェクション方法は異なります。通常は,カスタムXTN TAL Nuclease発現ベクターを各3μg(ペアでトータル6μg)使用します。目的の実験用途に応じて,使用量を調整して下さい。

Q9. どのようにカスタムXTN TAL Nucleaseを検証していますか。

A9. Transposagen社では,提供する配列を特異的に切断するようなカスタムXTN TAL Nucleaseのペアをデザインし,デザインの正しさを確認しています。出荷前に切断アッセイは行っていません。

Q10. 納品されたカスタムXTN TAL Nucleaseが目的配列を切断しなかったら,どうすればいいですか。

A10. トランスフェクション効率やクロマチン構造,標的DNAへの近接のしやすさなど,切断に影響を及ぼす因子は多くあります。Transposagen社の提供するカスタムXTN TAL Nucleaseは,Naked DNAを切断することは確認済みですが,in vivoにおける標的配列へのアクセスについては予測することが困難です。遺伝子座によっては,TAL Effectors Nucleaseが正しく構築されていても,うまく標的配列を切断できないこともあります。もし,適切な実験系でトランスフェクションを繰り返し行ったにも関わらず,TAL Effectors Nucleaseの切断活性が得られなかった場合は,1回に限り標的配列近傍に対する別のTAL Effectors Nucleaseを無償で作製します。

Q11. TAL Effectors Nucleaseの長さはどれくらいですか。

A11. Transposagen社では,カスタムXTN TAL NucleaseのDNA結合モジュールの鎖長を17塩基対にデザインしていますが,標的配列により異なることもあります。

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