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[掲載日情報:2017/09/01 現在]

PromoCell社 凍結細胞の融解~サブカルチャー方法について

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Q PromoCell 社 凍結細胞の融解~サブカルチャー方法について

A
  1. 培地の調製
    推奨播種密度を参考に,必要な培養面積を算出します。
    PromoCell 社の培地を培養フラスコに適量(細胞 1 vial につき 9 ml 以上)入れます。 インキュベーター(37℃, 5% CO2)内に 30 分間静置します。
  2. 細胞の融解
    バイアルを液体窒素コンテナから取り出し,直ちにドライアイス上に置きます。 コンテナとドライアイスの位置は極力近づけて下さい。 バイアルを 37℃のウォーターバスに浸し,90 秒間穏やかに撹拌します。
  3. バイアルの消毒と細胞播種
    コンタミネーションを防止するため,バイアルを 70%エタノールで消毒します。 バイアルを拭き,層流型クリーンベンチ内でバイアルのふたを開けます。 バイアル内の細胞を,慎重にピペットで再懸濁します。 ステップ 1 で準備したフラスコ内に細胞を移します。
  4. インキュベーション
    フラスコをインキュベーター(37℃, 5% CO2)内に静置し,細胞を接着させます。 16 ~ 24 時間後に培地を交換します。 細胞がコンフルエント(70 ~ 90%)に達した後,サブカルチャーを 行います。
  5. 試薬の調製および細胞の洗浄
    PromoCell社のlink('DetachKit','#')); ?>を少なくとも30分間室温に置いて下さい。 培養フラスコから慎重に培地を吸引します。 培養フラスコ表面にHepes BSS*を100μl/cm2加え,15秒間穏やかに振とうして細胞を洗浄します。
  6. 細胞の剥離
    培養フラスコからHepes BSSを慎重に吸引します。
    トリプシン/EDTA溶液を100μl/cm2加えます。
    細胞の剥離は室温で行うことを推奨します。
    蓋を閉め,顕微鏡で細胞を観察して下さい。
    細胞が剥離し始めたら,培養フラスコの側面を軽く叩いて残っている細胞も剥離させて下さい。
  7. トリプシンによる中和と細胞の播種
    培養フラスコ表面にTrypsin Neutralization Solution*を100μl/cm2加え,穏やかに振とうします。
    細胞懸濁液を慎重に吸引し,遠心チューブに移します。
    220×gで3分間遠心し,細胞を沈殿させます。
  8. 細胞のインキュベーション
    上清を捨て,適切なPromoCell Growth Mediumを1 ml加えます。
    ピペッティングにより,細胞を慎重に再懸濁します。
    新しい培養フラスコに37℃に温めたPromoCell Growth Mediumを入れます。
    推奨播種濃度に従って,新しい培養フラスコに細胞を播種します。
    培養フラスコをインキュベーター(37℃,5%CO2)内に置きます。
    印の試薬はDetachKitに含まれています。

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