生細胞を用いた脂肪滴の長時間イメージングに有用です！ LipiDye^®Ⅱ

長時間の生細胞イメージングに優れた高感度な脂肪滴染色試薬です。高い脂肪滴特異性に加え、低毒性かつ極めて高い光安定性を誇り、数日単位の長時間観察や脂肪滴融合・分解プロセスの生細胞イメージング、超高解像度顕微鏡での超微小脂肪滴の可視化に有用です。

※ 本製品は名古屋大学 トランスフォーマティブ生命分子研究所　山口茂弘教授、多喜正泰特任准教授の研究成果をもとに、フナコシ株式会社が製品化し、販売しています。
※ LipiDye^®Ⅱは、☞ LipiDye^®（#FDV-0010）の改良版試薬です。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。

＊ 488 nmレーザーでも励起可能ですが、405～473 nmレーザーに比べ得られる蛍光強度が弱いため、目的の実験ごとに観察条件の検証を推奨しています。

 励起／蛍光スペクトル   光安定性   細胞毒性   生細胞・固定細胞染色 

※ 図A～Cいずれも灰色網掛け領域が推奨の励起・蛍光波長。

 さまざまな細胞での染色   小胞体（ER）マーカーとのマルチカラーイメージング   脂肪細胞の分化過程の長時間観察 
 生細胞イメージングによる新生脂肪滴の動的挙動解析   脂肪滴分解・新生プロセスの経時的観察   蛍光プレートリーダーによる細胞内脂肪滴量の相対評価 
 STED超高解像度顕微鏡による微小脂肪滴の可視化   二光子顕微鏡によるミクログリアの観察 

3T3-L1、HepG2、COS-7、HeLa細胞それぞれをLipiDye^®Ⅱ（1 μM）で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で緑色蛍光（励起473 nm／蛍光490～540 nm）を観察した（スケールバー：20 μm）。HepG2細胞は脂肪滴形成のために脂肪酸で1日間処理した。HeLa細胞では1 μm以下の小さな脂肪滴が明瞭に観察できた（HeLa細胞拡大図（右側）参照、スケールバー：5 μm）。

小胞体（ER）局在性赤色蛍光タンパク質（ER-mKO1）を発現させたCOS-7細胞をLipiDye^®Ⅱ（1 μM）で染色し、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光観察（LipiDye^®Ⅱ：励起473 nm／蛍光490～540 nm、ER-mKO1：励起559 nm／蛍光570～620 nm）した。COS-7細胞の内在性の小さな脂肪滴（<1 μm）が観察され、その多くがERの網目構造の内側に局在することが観察された（右側拡大図参照、スケールバー：1 μm）。この結果は、脂肪滴がERから生合成されることと一致する。

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際の脂肪滴成熟の様子を、8日間にわたりLipiDye^®Ⅱ（1 μM）を用いて共焦点レーザー顕微鏡で生細胞観察した（励起473 nm／蛍光490～540 nm）。3T3-L1細胞を最初の2日間LipiDye^®Ⅱ（1 μM）を含む分化培地で培養した後、2日おきにLipiDye^®Ⅱ（1 μM）を含む維持培地に交換し、合計8日間蛍光観察した。LipiDye^®Ⅱで長期間処理しても、細胞毒性や脂肪細胞分化に影響を及ぼすことなく脂肪滴成熟過程を観察することができた。

脂肪前駆細胞3T3-L1を脂肪細胞に分化誘導する際に新生した脂肪滴の動的挙動を、長時間タイムラプスイメージング（Z-stackイメージング）で約24時間（共焦点レーザー顕微鏡：励起473 nm／蛍光490～540 nm、10分毎の撮影、Z-stack 20枚／回）観察した。あらかじめLipiDye^®Ⅱで染色した脂肪前駆細胞に分化培地（LipiDye^®Ⅱを含む）を添加した直後からタイムラプスイメージングを開始した。分化誘導後10時間程度経過した頃から小さな脂肪滴が見えはじめ（650 min、⇨）、個々の脂肪滴は互いに相互作用しながら大きくなっていく様子が観察された（950～1,450 min、➡）。

分化誘導した3T3-L1細胞にアデニル酸シクラーゼ活性化物質であるForskolin（10 μM）およびホスホジエステラーゼ阻害物質IBMX（100 nM）を添加し、トリアシルグリセロール分解に伴う脂肪滴の縮小過程をLipiDye^®Ⅱを用いたタイムラプスイメージング（Z-stackイメージング）で観察した（共焦点レーザー顕微鏡：励起473 nm／蛍光490～540 nm、800分間、4分毎の撮影、Z-stack 15枚／回）。もともと存在した大きな脂肪滴（⇨参照）は時間依存的に小さくなっていることが確認できる。また、時間依存的に小さな脂肪滴（◄）が多数生成していることが分かる。
LipiDye^®Ⅱは極めて高い光安定性を有することにより退色の心配がなく、高いS / N比を示すことにより微小の新生脂肪滴も観察できるため、脂肪滴の増減を定量的に観察可能であることが示された。

3種類の細胞株（ヒト腎がん細胞株 786-O、マウス神経芽細胞種 Neuro2a、チャイニーズハムスター卵巣細胞株 CHO）を96 wellプレートに1×10⁴ cell/wellで播種し、10% FBS/DMEM培地で24時間培養後、脂肪滴の産生を促進するため10～200 μMオレイン酸を含む10% FBS/DMEMに交換し、さらに24時間培養した。その後、細胞をPBSで洗浄し、LipiDye^®Ⅱ（5 μM）を含む2% FBS/DMEMで2時間染色した。PBSで2回細胞を洗浄し、蛍光プレートリーダーで蛍光強度（Ex 420±5 nm/Em 503±10 nm）を測定した。いずれの細胞においてもオレイン酸の添加濃度依存的に蛍光強度の増加が見られた。

HeLa細胞をLipiDye^®Ⅱ（1 μM）で染色し、共焦点レーザー顕微鏡（励起473 nm／蛍光490～540 nm）およびSTED超高解像度顕微鏡（励起473 nm＋STED 660 nm／蛍光500～640 nm）で微小脂肪滴の観察を試みた。STED観察像はDeconvolution処理を行ったデータを示している。共焦点レーザー顕微鏡では不明瞭な微小脂肪滴が観察されたのに対し、STED顕微鏡では明瞭に確認され、半値幅（FWHM）は約120 nmであった。
※ STED顕微鏡の観察条件および解析方法は☞ 原著論文をご参照下さい。

ラット初代培養ミクログリアにLipiDye^®Ⅱ（1 μM）を添加し終夜染色後、4% PFAで固定し二光子顕微鏡（励起 800 nm／蛍光 510～560 nm）で観察した。LipiDye^®Ⅱは二光子励起法でも励起が可能で、初代培養ミクログリアにおける大小さまざまなサイズの脂肪滴を検出できた。

（データ提供：Dr. Hyun Beom Choiおよび Dr. Brian MacVicar, The University of British Columbia）