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LipiRADICAL® Green (検出試薬)／OH-Pen（阻害物質）
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LipiRADICAL® Green (検出試薬)／OH-Pen（阻害物質）
脂質ラジカル検出試薬と阻害物質（脂質過酸化研究のための新しいツール） LipiRADICAL® Green (検出試薬)／OH-Pen（阻害物質）
掲載日情報：2023/02/01 現在Webページ番号：69338
フナコシ /
フナコシ株式会社
[メーカー略称：FNA]
LipiRADICAL® Greenは脂質過酸化反応の上流因子である脂質ラジカル特異的な蛍光性検出試薬です。生細胞イメージング、試料中の脂質ラジカル量の相対定量、さらには試料中の脂質ラジカルの構造解析・網羅的同定に利用できます。また、OH-Penは脂質ラジカル特異的な中和剤としてご活用いただけます。
※ 本製品は九州大学大学院 薬学研究院 生命物理化学分野 山田健一教授の研究成果をもとに、フナコシ株式会社が製品化し、販売しています。
※ 本製品は研究用です。研究用以外には使用できません。
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脂質過酸化反応（LPO）と脂質ラジカル（Lipid radical）について
脂質過酸化反応（LPO）とは
脂質過酸化反応（lipid peroxidation; LPO）は酸化ストレスがきっかけで脂質が酸化的に分解する反応で、脂質の分解過程の一つです。脂質過酸化反応は、多価不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid; PUFA）を含む脂質を起点に2つの発生プロセスが提案されています。
- 酸化ストレスによる脂質ラジカルの産生
- Lipoxygenaseによる過酸化脂質の生成と鉄イオン依存的な過酸化脂質ラジカルの産生
第1の発生プロセスとして、PUFAを含む脂質が酸化ストレス（活性酸素種ROS）に曝された際に脂質ラジカル（L・; Lipid radical）が発生することから始まります。脂質ラジカルは容易に酸化され過酸化脂質ラジカル（LOO・; Lipid peroxyl radical）に変換され、ラジカル連鎖反応が誘導されます。第2の発生プロセスとして、PUFAを含む脂質が過酸化触媒酵素lipoxygenaseにより過酸化脂質（LOOH）に変換され、さらに鉄イオンFe2+が多く存在する時には過酸化脂質ラジカル（LOO・）が誘導されます。過酸化脂質ラジカルは他の脂質と反応し、ラジカル連鎖反応が誘導されます。
いずれのプロセスにおいても発生した過酸化脂質ラジカル（LOO・）が他の脂質とラジカル反応しラジカル連鎖反応が拡大するとともに、様々な過酸化脂質（LOOH）が産生されます。このラジカル連鎖反応は抗酸化物質により収束するまで続き、多様な脂質構造やアルデヒドが発生し最終的に、acrolein、 malondialdehyde (MDA)、4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE) などの複数の反応活性アルデヒドを産生します。これら下流の活性物質が起因してERストレスや細胞毒性、フェロトーシスの誘導など様々な影響を与えることが知られています。
脂質ラジカル（Lipid radical）の検出および選択的（または特異的）阻害物質
脂質ラジカル（および過酸化脂質ラジカル）は脂質過酸化反応の最上位因子として最も重要な存在と考えられており、この検出方法が期待されていますが、これまでは電子スピン共鳴（ESR）法など特殊な機器が必要な方法など非常に限定的でした。LipiRADICAL® GreenおよびOH-Penは九州大学大学院 薬学研究院 生命物理化学分野の山田健一教授らにより開発された、新規ニトロキシド骨格を持つ世界初の脂質ラジカル応答性蛍光試薬（原著名 NBD-Pen）および阻害物質で、活性酸素ラジカルには反応せず脂質ラジカル特異的な応答を示します。LipiRADICAL® Greenは蛍光検出により脂質ラジカルを観察・解析できるため、脂質ラジカルを中心とした脂質過酸化反応の新たなツールとして活用できます。OH-PenはLipiRADICAL®から蛍光基NBDを除いた化合物で、一般的なラジカル中和剤（TEMPOなど）とは異なり脂質ラジカルに対する高い選択性を示すため、脂質過酸化反応の特異的な阻害物質として使用できます。
脂質過酸化反応
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検出原理
LipiRADICAL® Greenは安定ラジカル性化合物であるニトロキシド誘導体に蛍光色素NBDを付加した化合物です。ニトロキシドには脂質ラジカルに対する特異性を高めるためペンチル基が導入されています。LipiRADICAL® Greenはこの状態では消光状態にありますが、脂質ラジカルとラジカル‐ラジカルカップリングにより共有結合を形成すると緑色蛍光を示します。この緑色蛍光強度を観察することで試料中の脂質ラジカル量を相対定量することが可能です。
OH-PenはLipiRADICAL® GreenのNBDをヒドロキシル基に変換した化合物で、同様の脂質ラジカル選択性を示し、脂質ラジカルの中和効果を有します。これにより脂質過酸化反応の阻害物質として使用できます。
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LipiRADICAL® Green
特長
- 本試薬は消光状態にあり、脂質ラジカル・過酸化脂質ラジカルに特異的に反応し、緑色蛍光を発します。
- 検出波長目安：励起 470 nm / 蛍光 520～600 nm（極大 ～540 nm）※ 詳しくは☞ 参考データをご参照下さい。
- 脂質ラジカルおよび過酸化脂質ラジカルに特異的で、活性酸素種（H2O2、ClO-・、 O2-・、・OH）では蛍光は生じません。
- in vitro試料中の脂質ラジカル含有量を蛍光強度で相対定量できます。
- 動物個体に投与後、組織レベルでの染色および生体内ラジカル量の相対定量が可能です。
※ 脂質ラジカルは非常に不安定で迅速に分解するため、実験方法および条件設定には検証が必要です。詳細は☞ 原著論文1をご参照下さい。 - 任意の化合物の脂質ラジカル誘導活性の評価や抗酸化活性の評価に有用です。
※ 詳細は☞ 原著論文4をご参照下さい。 - 蛍光検出LC/MSを用いることで脂質ラジカル・過酸化脂質ラジカルの網羅的構造解析に有用です。
※ 脂質ラジカル・過酸化脂質ラジカルの構造解析方法は☞ 原著論文5をご参照下さい。
参考データ
脂質ラジカル特異的な蛍光スペクトル
LipiRADICAL® Greenにアラキドン酸（AA）およびLipoxygenase（LOX）を添加し、470 nm励起に対する蛍光を観察した。LOX未添加条件下ではほとんど蛍光が観察されないのに対し、LOXを添加し脂質ラジカルを発生させた際に500～650 nmの領域の蛍光（極大540 nm付近）が観察された（左）。蛍光強度は添加したLOX濃度に依存していることが分かる（右）。
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ラジカル特異性
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LipiRADICAL® Greenを用いた脂質ラジカルの網羅的解析
LipiRADICAL® Greenを用いた蛍光検出LC/MS-MS法により脂質ラジカルおよび過酸化脂質ラジカル網羅的解析が可能です。原著論文5では、5種類のPUFAから計132種類の脂質ラジカルの同定に成功しています。下記はフローの概略になりますが、詳細なプロトコール、LC/MS-MSの設定方法・分析方法は☞ 原著論文5をご参照下さい。
概略
LipiRADICAL® Greenを用いた脂質ラジカルの網羅的解析
- Step 1：本試薬を含脂質ラジカル試料に添加し、脂質ラジカルを蛍光標識する。
※動物実験の場合、マウス等の動物に本試薬を投与し動物内で脂質ラジカルを蛍光標識したのち、臓器を摘出、脂質画分を抽出する。 - Step 2：蛍光検出LC/MSにより緑色蛍光標識産物の質量分析を行う。
- Step 3：得られた質量値からLipiRADICAL® Greenの分子量（理論値389.2068）を差し引き、構造推定を行う。
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アプリケーションデータ
生細胞イメージング
Hepa1-6細胞にLipiRADICAL® Green（1 μM）添加し20分間培養したのち、発がん性ニトロサミン化合物DEN（30 mM）追添加してから20分間、2分毎に共焦点レーザー蛍光顕微鏡で生細胞イメージング（励起：458 nm／蛍光：490～674 nm）を行った。DENで処理した細胞では添加直後から経時的な蛍光強度の上昇が観察され、DENにより脂質ラジカルが順次産生されていることが分かる。蛍光顕微鏡画像は20分後のデータである。
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in vitroにおけるLDL由来脂質ラジカル検出
精製した低密度リポタンパク質LDL（20 μg protein/ml）に酸化誘導物質であるHeminまたはAAPHを処理し、LipiRADICAL® Green（10 μM）を添加し蛍光強度（励起：470 nm／蛍光：530 nm）を1時間経時観察した。Hemin、AAPHともに経時的および試薬濃度依存的な蛍光強度の増加が検出され、それぞれ増加傾向が異なっていることが分かる。
使用文献
- Mishima, E., et al., "A non-canonical vitamin K cycle is a potent ferroptosis suppressor.", Nature, 608 (7924), 778～783 (2022). [PMID:35922516]
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OH-Pen
特長
- 脂質ラジカル・過酸化脂質ラジカルと特異的に反応しラジカル連鎖反応を抑制するため、脂質過酸化反応シグナル上流の阻害物質として利用できます。
- ラジカル性化合物ですが、非常に安定でin vivo動物個体にも投与可能です。
- 肝細胞がんの動物実験モデル（Diethylnitrosamine（DEN）投与モデル）で、DENが誘発する脂質過酸化反応シグナルおよび組織障害マーカーを抑制することが分かっています。
注意：LipiRADICAL® GreenとOH-Penの違いは蛍光基の有無（☞ 検出原理参照）で、脂質ラジカルに対する反応性は同じです。同時に使用すると脂質ラジカルに対する競合反応が起こる可能性があります。併用される場合はプロトコールにご注意下さい。
アプリケーションデータ
脂質ラジカル構造解析
1）酸化誘導物質（AAPH+Hemin）による産生ラジカルの評価
in vitroにおいてアラキドン酸（AA）にLOX（10 μg/ml）および酸化誘導物質AAPH＋Hemin（10 μM）を添加して脂質ラジカルを誘導したのち、LipiRADICAL® Greenを添加して検出反応を行った。その後、脂質成分をBligh & Dyer法で精製し、蛍光LC/MS-MSでAAから生成したラジカルの網羅的解析を行った。
※ 詳細なプロトコールおよび解析方法は☞ 原著論文5をご参照下さい。
2）DEN誘導時の内在的産生脂質ラジカル検出
マウスに発がん性ニトロサミン化合物DENを投与し、1、4、24時間後にそれぞれ麻酔をし、LipiRADICAL® Greenを腹腔内投与した。その後、肝臓を摘出・破砕し、Bligh & Dyer法により脂質抽出液を調製した。各抽出液を蛍光LC/MSにより各脂質ラジカルの同定および相対定量を行った。なお、脂質ラジカル阻害物質OH-PenはNBD-Pen投与の15分前に投与した。左図のような蛍光LCクロマトグラフが観察され、計11種類の脂質ラジカルをMS/MS分析で同定した。各脂質ラジカル種を経時的に観察（右図は・C5H11の例）すると、いずれもDEN投与後4時間で大幅な増加が観察され、24時間後には減少していた。LipiRADICAL® Greenを投与前にOH-Penを投与したマウスでは、脂質ラジカルは顕著に抑制されていた。
※ 詳細なプロトコールおよび解析方法は☞ 原著論文5をご参照下さい。
3）本試薬によりin vitroで同定された脂質ラジカル
本試薬を用いて5種類のPUFA（リノール酸LA、α-リノレン酸ALA、アラキドン酸AA、ドコサヘキサエン酸DHA、エイコサペンタエン酸EPA）からLOX、AAPHおよびHemin処理で同定された脂質ラジカル一覧は☞ こちらからご参照頂けます（原著論文5より抜粋したものになります）。
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OH-Penによるニトロサミン誘導肝細胞がんの抑制
ラットに発がん性ニトロサミン化合物DENを投与後、1時間後にOH-Penを追投与した。その後、慢性モデルとして12週間後、急性モデルとして24時間後にラットから肝臓を摘出した。
1）慢性モデルにおける肝臓がんの様子
DEN投与により多数の悪性腫瘍の亢進が認められるが、OH-Penの投与により顕著に抑制されていた。
2）急性モデルにおけるLPO代謝産物の定量評価
LPOの下流産物であるMDA, 4-HNEおよびAcroleinを評価したところいずれもDENによる増加をOH-Penが抑制していることが分かる。
3）急性モデルにおける組織障害性マーカーの定量評価
8-OHdG、ALTおよびアポトーシス量を評価したところ、いずれもDENによる増加をOH-Penが抑制していた。
これらの結果から、DENによりLPOが亢進し脂質ラジカルが生成後、各種毒性シグナルが誘導されるのに対し、OH-Penが初期の脂質ラジカル連鎖反応を阻害することでがん化を抑制していると考えられる。
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原著論文
- Yamada, K., et al., "Fluorescence probes to detect lipid-derived radicals.", Nat. Chem. Biol., 12 (8), 608～613 (2016). [PMID:27294322]
- Enoki, M., et al., "Lipid radicals cause light-induced retinal degeneration.", Chem. Commun., 53 (79), 10922～10925 (2017). [PMID:28930310]
- Ishida, Y., et al.,"Detection and inhibition of lipid-derived radicals in low-density lipoprotein.", Free Radical Biol. Med. ,113, 487～493 (2017). [PMID:29107744]
- Mishima, E., et al., "Drug Repurposed as antiferroptosis agents suppress organ damage, including AKI, by functioning as lipid peroxyl radical scavengers.", J. Am. Soc. Nephrol., 31 (2), 280～296 (2020). [PMID:31767624]
- Matsuoka, Y., et al., "Method for Structural Determination of Lipid-Derived Radicals.", Anal. Chem., 92 (10), 6993～7002 (2020). [PMID:32311262]
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価格
LipiRADICAL® Green
[在庫・価格 ：2024年04月19日 16時35分現在]
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LipiRADICAL Green <Lipid Radical Detection Reagent> |
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[在庫・価格 ：2024年04月19日 16時35分現在]
LipiRADICAL Green <Lipid Radical Detection Reagent>
文献数： 0
- 商品コード：FDV-0042
- メーカー：FNA
- 包装：0.1mg
- 価格：¥38,000
- 在庫：1個
- 納期：1週間程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
| 説明文 |
脂質過酸化反応（Lipid peroxidation; LPO）の上流因子である脂質ラジカル（Lipid radical）に特異的な蛍光性検出試薬です。生細胞イメージング，試料中の脂質ラジカル量の相対定量，さらには試料中の脂質ラジカルの構造解析・網羅的同定に利用できます。（励起 470 nm／蛍光520-600 nm）。 |
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| 法規制等 | |||
| 保存条件 | -20℃ | 法規備考 | |
| 掲載カタログ |
ニュース2021年6月1日号 p.16 ニュース2021年3月1日号 p.32
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| 製品記事 | |||
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OH-Pen
[在庫・価格 ：2024年04月19日 16時35分現在]
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OH-Pen <Lipid Radical Inhibitor> |
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[在庫・価格 ：2024年04月19日 16時35分現在]
OH-Pen <Lipid Radical Inhibitor>
文献数： 0
- 商品コード：FDV-0043
- メーカー：FNA
- 包装：0.1mg
- 価格：¥33,000
- 在庫：3個以上
- 納期：1週間程度 ※※ 表示されている納期は弊社に在庫がなく、取り寄せた場合の目安納期となります。
- 法規制等：
| 説明文 |
脂質過酸化反応（Lipid peroxidation; LPO）の上流因子である脂質ラジカル（Lipid radical）を特異的に阻害する化合物です。脂質過酸化反応を上流で抑制できます。 |
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| 法規制等 | |||
| 保存条件 | -20℃ | 法規備考 | |
| 掲載カタログ |
ニュース2021年6月1日号 p.16 ニュース2021年3月1日号 p.33
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| 製品記事 |
脂質過酸化研究用製品特集 |
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