Atlas Antibodies社 標準免疫組織染色プロトコール(モノクローナル抗体用)

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Atlas Antibodies社では,マウスモノクローナル抗体も販売しております。


モノクローナル抗体の製造に利用される組換え体タンパク質抗原は,同社のポリクローナル抗体と同じ独自の手法を用いて選別されています。モノクローナル抗体の製造過程では,独自の配列領域の選別および,適用の検証において顕著なパフォーマンスを示すクローンの選別を組み合わせて行っています。現在同社より販売されているモノクローナル抗体は,免疫組織染色およびウエスタンブロットで検証されています。


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1脱パラフィン操作

4μm厚のパラフィン切片を50℃で一晩ベーキングする

脱パラフィンをキシレンで行い,さらにエタノールから蒸留水へ段階的に親水化させる。

なお内在性ペルオキシダーゼのブロッキングは,親水化の過程において0.3%の過酸化水素水を含む95%エタノール中で5分間行う。


2標準抗原賦活化操作

標準的な抗原賦活化は加熱による方法(Heat Induced Epitope Retrieval;HIER)をpH6の賦活化バッファー(弊社ではLab Vision社 #AP-9003-125等を取り扱っております)中で行います。
圧力釜は,Biocare Medical社のDecloaking Chamberを使用します。
Tissue Micro Array slideを圧力釜中で125℃,4分間賦活化バッファー内に浸して行い,完了後は90℃になるまで静置します。全ての操作はおよそ45分程度です。


3染色操作

・染色はLab Vision社 Autostainer480により行っています。

・すべてのインキュベーションは室温条件下で行っています。

・Ultra V Block, Primary Antibody Enhancer, 標識ポリマー, DAB溶液はLab Vision社UltraVision LP Detection System(弊社では #TL-015-HD等を取り扱っております)を使用しています。


1.スライドを洗浄バッファーで洗う。

2.Ultra V Blockにて5分間インキュベーション

3.スライドを洗浄バッファーで洗う(2回)

4.一次抗体を滴下し30分間インキュベーション

5.スライドを洗浄バッファーで洗う(3回)

6.Primary Antibody Enhancerを滴下し20分間インキュベーション

7.スライドを洗浄バッファーで洗う(2回)

8.標識ポリマー(弊社ではLab Vision社 #TL-015-HD等を取り扱っております)を滴下し30分間インキュベーション

9.スライドを洗浄バッファーで洗う(2回)

10.DAB溶液を滴下し,常温で5分間反応させる

11.スライドを洗浄バッファーで洗う(2回)

12.DAB溶液を滴下し,常温で5分間反応させる

13.蒸留水で洗浄

14.ヘマトキシリン溶液で5分間対比染色

15.水道水で5分間洗浄

16.飽和炭酸リチウム水溶液を6倍希釈した水溶液で1分間洗浄

17.水道水で5分間洗浄

18.段階的なエタノールティシュークリアで脱水・透徹を行う

19.封入する


4他の抗原賦活化法

・いくつかの抗体についてはデータシート・Human Protein Atlasポータルサイトに,別の方法で抗原賦活化を行うよう記載されている場合もあります。

・タンパク質分解酵素を用いた方法(Proteinase K溶液中にて10分間行う)

・加熱による方法(pH9の抗原賦活化バッファーを用いてHIERを行う)

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