Atlas Antibodies社 標準免疫組織染色プロトコール(ポリクローナル抗体用)

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Atlas Antibodies社はそれぞれの抗体について500以上の免疫組織染色画像を取得し,proteinatlas.orgに掲載しています。その免疫組織染色では,下記の標準的なプロトコルを採用しています。


Atlas Antibodies社モノクローナル抗体用免疫組織染色プロトコールはこちら


1脱パラフィン操作

4μm厚のパラフィン切片を50℃で一晩ベーキングする

脱パラフィンをキシレンで行い,さらにエタノールから蒸留水へ段階的に親水化させる。

なお内在性ペルオキシダーゼのブロッキングは,親水化の過程において0.3%の過酸化水素水を含む95%エタノール中で5分間行う。


2標準抗原賦活化操作

標準的な抗原賦活化は加熱による方法(Heat Induced Epitope Retrieval;HIER)をpH6の賦活化バッファー(弊社ではLab Vision社 #AP-9003-125等を取り扱っております)中で行います。
圧力釜は,Biocare Medical社のDecloaking Chamberを使用します。
Tissue Micro Array slideを圧力釜中で125℃,4分間賦活化バッファー内に浸して行い,完了後は90℃になるまで静置します。全ての操作はおよそ45分程度です。


3染色操作

・染色はLab Vision社 Autostainer480により行っています。

・すべてのインキュベーションは室温条件下で行っています。

1.スライドを洗浄バッファーで洗う。

2.Ultra V Blockにて5分間インキュベーション

3.スライドを洗浄バッファーで洗う(2回)

4.一次抗体を滴下し30分間インキュベーション

5.スライドを洗浄バッファーで洗う(3回)

6.標識ポリマー(弊社ではLab Vision社 #TL-015-HD等を取り扱っております)を滴下し30分間インキュベーション

7.スライドを洗浄バッファーで洗う(2回)

8.DAB溶液を滴下し,常温で5分間反応させる

9.スライドを洗浄バッファーで洗う(2回)

10.DAB溶液を滴下し,常温で5分間反応させる

11.蒸留水で洗浄

12.ヘマトキシリン溶液で5分間対比染色

13.水道水で5分間洗浄

14.飽和炭酸リチウム水溶液を6倍希釈した水溶液で1分間洗浄

15.水道水で5分間洗浄

16.段階的なエタノールティシュークリアで脱水・透徹を行う

17.封入する


4他の抗原賦活化法

・いくつかの抗体についてはデータシート・Human Protein Atlasポータルサイトに,別の方法で抗原賦活化を行うよう記載されている場合もあります。

・タンパク質分解酵素を用いた方法(Proteinase K溶液中にて10分間行う)

・加熱による方法(pH9の抗原賦活化バッファーを用いてHIERを行う)

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