QP法を用いた微生物群集構造解析受託サービス

: ニッテツジュウキンカンキョウカブシキカイシャ / 日鉄住金環境株式会社

[掲載日情報：2012/03/05 現在]

蛍光消光現象（QP：Quenching phenomenon）を利用した遺伝子解析手法により，土壌や地下水などの環境試料中に混在する微生物を解析する受託サービスです。

特　　長

高性能なDNA抽出キットを使用
試料中の微生物群集をより正確に把握するためには，微生物種によってDNA抽出効率に差が生じないこと，分析に適した純度の高いDNA試料を得ることが重要です。
強固な細胞壁を持つ微生物種からも効率よくDNAを抽出することが可能で，夾雑物の多い環境試料から高純度のDNAを抽出できる「Extrap Soil DNA Kit Plus ver. 2」を使用することで，精度の高い結果が得られます。
試料ごとに，最適なPCR増幅サイクル数を予備検討
試料から抽出したDNAは，PCR法により増幅した後に分析に用います。
しかし，PCRの反応後期では，PCRバイアス^＊1やアーティファクト生成^＊2といった，分析結果に悪影響を及ぼす現象が起こりやすいため，過度のPCR増幅は禁物です。
一方，PCR増幅サイクル数が少なすぎると，分析に十分な量の増幅産物が得られません。
そこで日鉄環境エンジニアリング株式会社　J-Bio21センターでは，予めQPrimer-PCR^＊3を実施して増幅過程をモニタリングすることにより，PCRバイアスやアーティファクトの生成を低減し，かつ分析に十分な増幅産物を得ることができる最適なサイクル数を，試料ごとに決定します。

＊1PCRバイアス：主にPCR反応後期に増幅に偏りが生じ，増幅産物の構成比が元のテンプレートの構成比からずれてしまう現象。
＊2アーティファクト：主にPCR反応後期に試料中に本来存在しなかったDNA配列が生成されてしまう現象。
＊3QPrimer‐PCR：蛍光消光プライマーを用いたリアルタイムPCR手法で，PCR産物の増幅過程を正確にモニタリングすることができる。

DNA抽出

土壌や地下水などの環境試料から，微生物群集構造解析に適したDNAを抽出します。

高性能なDNA抽出キット「Extrap Soil DNA Kit Plus ver.2」を使用して，効率よく高純度のDNAが得られます。

価　　格

内　容	価　格
DNA抽出	土壌，活性汚泥などの試料	￥5,000～/1試料
DNA抽出	地下水など，フィルターによる濃縮が必要な試料	￥7,000～/1試料

T-RFLP解析

細菌の集団構成パターンの比較や変化の追跡を簡易的に調べる手法です。

1種の微生物が１つのピークとして検出されるため，ピークの数は，試料中に存在する優占微生物の多様性を示す指標となります（ただし，異なる微生物種でも断片長が同じになる場合があり，１つのピークが複数の微生物種に由来することもあります）。

また，ピーク高の比から，そのピークに相当する微生物のおよその構成比を推定することができます。

T-RFLP解析のみでは，個々にピークに相当する細菌の種類を特定することはできませんが，クローン解析結果と比較することにより，どのピークがどの微生物種に相当するかを推定することは可能です。

作業内容

1. 真正細菌（バクテリア）の16S rRNA遺伝子を，蛍光標識プライマーを用いて増幅する（PCR増幅）

→ PCR産物の末端が蛍光標識される

2. PCR増幅産物を制限酵素処理する

→ DNA塩基配列の違いにより，異なる部位で切断される

3. DNAシークエンサーを用いて電気泳動する

→ 蛍光標識されたDNA断片がピークとして検出される

→ 微生物種の違い（DNA配列の違い）によって，ピークの出現位置が異なる

価　　格

内　容		価　格
T-RFLP解析	基本料金（ご依頼1回当りのセットアップ費用）	￥20,000/1回
T-RFLP解析	分析料金	￥20,000/1試料

※試料からのDNA抽出費用は含まれていません。

例1）1回で4試料まとめてご依頼いただく場合

基本料金￥20,000＋分析料金\20,000×4試料＝￥100,000

例2）2試料ずつ2回に分けて，合計4試料ご依頼いただく場合

基本料金￥20,000×2回＋分析料金￥20,000×4試料＝￥120,000

クローン解析

試料中に混在する微生物の種類と存在割合を推定する手法です。

様々な微生物種のDNAが混在する試料からPCR増幅したDNA断片を1つずつに分別（クローニング）し，その中からランダムに選んだ96個のDNA断片の塩基配列を解読します。得られた塩基配列情報をデータベースと照合することにより，それぞれのDNA配列がどのような微生物種に近いかを推定します。

存在割合の高い微生物種由来のDNAほど，検出される確率が高くなるという原理を利用して，どのような微生物種の構成割合が高いかを推定することができます。

作業内容

1. 精製DNA試料から，標的とする微生物DNA（バクテリアの16S rRNA遺伝子など）を増幅する（PCR増幅）。

2. PCR増幅されたDNA断片を挿入したプラスミドを，E. coliに形質転換して培養する。

→ 1つのコロニーに1種類のプラスミドDNAが導入された状態になる（クローニング）。

3. 得られたコロニーの中からランダムに96コロニーを選択する。

4. 選択した各コロニーから抽出したプラスミドDNAの塩基配列を解析する（シークエンス解析）。

5. 解読した塩基配列をデータベースと照合し，どの微生物種に近縁であるかを推定する（相同性検索）。

※ご要望に応じて，対象とする遺伝子や解析クローン数の変更も可能です。
※解析クローン数は，96クローン単位とさせていただきますが，48クローン×2試料，32クローン×3試料というような解析も可能です。

ご注文方法／価格

詳細は当社受託・特注品業務担当までお気軽にお問い合わせ下さい。

※価格，納期などについては，ご依頼内容に応じて個別にお見積りいたします。

お問い合わせ先（受託・特注品業務担当）

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