GFP融合タンパク質のクロマチン免疫沈降法（ChIP Assay）

1. DNA-GFP標識タンパク質複合体とGFP-Trap Aビーズを混合し，インキュベートする。

2. 遠心によりGFP-Trap Aに結合したDNA-GFP標識タンパク質複合体を単離し，回収する。

3. DNAを精製し，PCRにより解析する。

IGF-binding protein 1（IGFBP1）およびInterleukin 6（IL6）遺伝子のプロモーター領域に結合するタンパク質HMGA1a（High motility group protein A1a）について，GFP-Trap Aを用いたChIPアッセイを行った。

試料として，GFP融合HMGA1a タンパク質（HMGA1a-GFP）を恒常発現するC2C12細胞を用いた。細胞にホルムアルデヒドを添加し，DNAに結合しているタンパク質を架橋した後，超音波で断片化した。調製した核タンパク質試料(500μg)にGFP-Trap A（5μg），抗GFP抗体（10μg），マウスIgG₁アイソタイプコントロール（10μg）をそれぞれ加え免疫沈降を行った。回収したDNA-HMGA1a-GFP複合体からDNAを精製し，IGFBP1およびIL6のプロモーター領域と下流領域（distal region 1, 2）のプライマーペアを用いてリアルタイムPCRで解析した。グラフの縦軸はマウスIgG₁アイソタイプコントロールを使用した結果に対する相対量を示している。

GFP-Trap Aを使用したChIPアッセイでは，抗GFP抗体を使用した場合よりも，特異的で高収率な結果が得られることがわかる。

GFP融合酵素の精製と活性測定

1. GFP融合酵素を含む細胞ライセートとGFP-Trap Aビーズを混合する。

2. 遠心によりGFP融合酵素とGFP-Trap Aビーズの複合体を単離し，回収する。

3. 酵素活性を測定する。

DNA methyl transferase 1（Dnmt1）は哺乳動物細胞で最も多く含まれるDNAメチル基転移酵素である。GFP-Trap Aを用いて，細胞ライセートに含まれるGFP融合Dnmt1を1ステップで精製し，その酵素活性を測定した。

試料として，GFP融合Dnmt1（GFP-Dnmt1）および不活性型の変異体であるGFP融合Dnmt1（GFP-Dnmt1(P1229W)）を恒常発現するHEK293T細胞を使用した。それぞれの細胞ライセートにGFP-Trap Aビーズを加えて混合し，免疫沈降を行った。回収したGFP-Dnmt1とGFP-Trap Aビーズ複合体に[³H]標識アデノシルメチオニンを含むメチル化酵素の活性測定試薬を添加し，酵素活性を測定した。

上図は回収したGFP-Dnmt1のSDS-PAGE像。下図は酵素活性の測定結果。ポジティブコントロールとして組換え体Dnmt1を使用した。「control」は酵素を加えていないネガティブコントロールを示す。

GFP-Trap Aにより，GFP-Dnmt1だけでなく不活性型の変異体GFP-Dnmt1(P1229W)も単離・回収できた。また，GFP-Trap Aビーズに結合した状態でも酵素活性の測定が可能であった。