お客様より提供されたターゲティングベクターを胚性幹（ ES ）細胞にエレクトロポレーションし，G418 耐性コロニーを選択します。耐性コロニーを 24 ウェルプレートにピックアップし，PCR またはサザンブロッティングにより相同組換え体の同定を行います。同定された相同組換え体から ES 細胞ストックを作製し，凍結保存します。
目的の相同組換え ES 細胞クローンを 8 細胞期胚または胚盤胞期胚に注入し，受容雌マウスの子宮内に移植します。受容雌マウスの帝王切開により SPF 化したキメラマウスを作製します。キメラマウスは野生型マウスと交配することにより，生殖系列キメラを確認します。また，F1 産仔は PCR またはサザンブロッティングによりヘテロマウスの確認を行います。
※キメラマウスを作製する際の受容胚には，変異導入 ES 細胞が129Sv 系マウス由来の場合には C57BL / 6×DBA2（ BD ）F1 マウスまたは C57BL / 6マウスを，C57BL / 6 マウス系細胞由来の場合にはICR マウスを使用します。いずれも，日本チャールスリバー，日本クレアのいずれかの SPF マウスを使用します。
※遺伝子改変マウスの微生物モニタリングについては，遺伝子解析を実施したものについては同腹仔を，遺伝子解析を実施しなかったものについては里親を，財団法人実験動物中央研究所 ICLAS モニタリングセンターにて行い，納品時にマウス感染検査成績を添付いたします。
■変異導入 ES 細胞の作製サービスエレクトロポレーションによる ES 細胞へのターゲティングベクターの導入 129Sv 系または C57BL / 6 系の ES 細胞を用いてエレクトロポレーションを行い，G418 による薬剤耐性選別を行います。エレクトロポレーションは 2 回実施し，1 回当たり 120 コロニーの耐性クローンをピックアップし，計 240 コロニーを 24 ウェルプレート（ マスタープレートと解析用プレートの duplicate ）で培養した後に，凍結保存します。 ES クローンのスクリーニング 解析用の 24 ウェルプレートの ES 細胞から DNA を調製し，目的遺伝子の相同組換え体クローンを PCR またはサザンブロッティングにより同定します。 ■ES 細胞を用いたキメラマウスの作製サービス相同組換え ES クローンを用いたキメラマウスの作製 お客様より提供された変異導入 ES 細胞を 8 細胞期胚または胚盤胞期胚に注入し，受容雌マウスの子宮内に移植します。受容雌マウスの帝王切開により SPF 化したキメラマウスを作製します。原則として，離乳後（ 生後約 4 週齢 ）すべてのキメラマウスをお客様にお送りいたします。 生殖系列キメラの確認，ヘテロ個体作製，戻し交配，ホモ個体作製に関しては，別途ご相談に応じます。 ■医療の発展に貢献するノックアウトマウス ■ご用意いただくものターゲティングベクター（ 変異導入 ES 細胞の作製サービスのみの場合 ） ※ターゲティングベクターの構築は，原則としてお客様自身で行っていただきます。 お送りする DNA レポートに必要事項（ 開示可能な範囲でマップ，サイズなど ）をご記入の上，エレクトロポレーション用 DNA 溶液とともにご返送下さい。 ターゲティングベクター名は記号のみで表記するのではなく，その内容を分かりやすく記入して下さい。エレク トロポレーション用 DNA 溶液は，1 回のエレクトロポレーションで約 100μg / 100μl の線状 DNA を使用します。エレクトロポレーションは 1 件のご依頼につき 2 回行います。 変異導入 ES 細胞（ ES 細胞を用いたキメラマウスの作製サービスのみの場合 ） お送りする DNA レポートに必要事項（ 開示可能な範囲でターゲティングベクターなど ）をご記入の上，バイアル当たりの変異導入 ES 細胞数を明記して下さい（ 細胞数は 1×106 cells / バイアルが望ましい ）。 1 件のご依頼につき 3 クローン（ 2 バイアル／クローン ）を準備していただきます。変異導入 ES 細胞の輸送に際して，液体窒素用容器が必要な場合は，ご連絡下さい。 プライマー PCR によるスクリーニングをご依頼される場合は，プライマーセット，ポジティブコントロール DNA を，PCR 条件（ 温度，反応時間，サイクル数 ），導入遺伝子および内在遺伝子の予測される PCR 産物のサイズ等，解析に必要な条件を添えてお送り下さい。 プローブ用 DNA サザンブロッティングによるスクリーニングをご依頼される場合は，プローブ用 DNA，ポジティブコントロール DNA を，注入 DNA の鎖長，使用する制限酵素，導入遺伝子および内在遺伝子の予測されるバンドのサイズ等，解析に必要な条件を添えてお送り下さい。 ■価 格●変異導入 ES 細胞の作製 ……………………………………………………￥ 2,400,000 ●キメラマウスの作製 ……………………………………………………￥ 600,000 ※上記の価格はあくまでも目安です。委託の内容によりその都度お見積りいたしますので下記のご注文方法をご覧下さい。 ■ご注意相同組換え体が得られない場合は，目的遺伝子の特性，ターゲティングベクターの構築などに問題がある場合が多いと考えられます。したがって，異なるターゲティングベクターで行う際には，新たなご依頼として費用を別途申し受けます。 提供された試料およびお客様にお送りしなかった動物等については，業務終了後処分いたします。 ■ご注文お見積り依頼を受け次第，依頼内容調査書および開示に必要な機密保持契約書をお送りします。ご記入いただいた依頼内容調査書の内容を基に正式な見積書および試験計画書を作成します。 ご依頼に際しては，あらかじめお客様の施設内の組換え DNA安全委員会等により P1 施設内で実施可能との承認を受けていることを証明する書類を提出していただきます。 なお，受託契約の際には実験内容の機密保持に関する契約も併せて締結いたします。 ※詳細はお問い合わせ下さい。 |
| [掲載日情報：2005/05/01 現在] | ||||
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