膜内在性タンパク質，膜結合タンパク質の相互作用を in vivo で解析できる酵母 Two-Hybrid System（Y2H）です。粗面小胞体膜上で全長の目的タンパク質（bait および prey）を発現させることにより，相互作用のあるタンパク質のスクリーニングを効率良く行うことができます。 ■特 長 - Split-ubiquitin（下記「原理」参照）法を用いた Two-Hybrid システムです。
- 既知の膜タンパク質二量体形成の検出，相互作用領域の決定，cDNA ライブラリーからの結合タンパク質スクリーニングなどに有用です。また，膜タンパク質と可溶性タンパク質の相互作用の解析にも有用です。
- 宿主酵母（NMY51） は bait-prey の相互作用により， ADE2, HIS3 および lacZ をレポーターとして発現します。
- ADE2 の発現によりコロニーの色が赤から白へと変化するため，1 次スクリーニングが容易です。
- HIS3 の発現を SD 選択培地での培養でスクリーニングできます。
- lacZ の発現をβ-ガラクトシダーゼアッセイで検出します。
- 目的膜タンパク質の性質に適したベクターが含まれています。
- NubG（ユビキチン変異N 末端領域）を融合させた cDNA ライブラリー（下記参照）を使用して，目的の膜内在性タンパク質と相互作用のあるタンパク質をスクリーニングできます。
■原 理  bait はユビキチン C 末端領域（Cub）- 人工転写因子（LexA-VP16）との融合タンパク質として，prey はユビキチン変異 N 末端領域（NubG）との融合タンパク質として宿主酵母（NMY51）で発現させます。bait と prey が相互作用すると Cub と NubG によりユビキチン（これを split-ubiquitin と呼ぶ）が再構成され，ユビキチン特異的プロテアーゼ（UBPs）によって Cub C 末端から LexA-VP16 が切り離されます。LexA-VP16 は核内に移行し，レポーター遺伝子である ADE2， HIS3 および lacZ が発現されることにより，タンパク質の相互作用を解析できます。 ■ベクターの選択 本システムは bait の Cub-LexA-VP16 および prey の NubG が細胞質内に存在することで機能します。キットに含まれる各種ベクターから目的タンパク質の方向性に適したベクターを選択してご使用下さい。 ■ 目的タンパク質の性質による bait ベクターの選択 Type I 膜内在性タンパク質例：レセプターチロシンキナーゼ，接着タンパク質 | 方向性 | N 末端：粗面小胞体内腔 | C 末端：細胞質内 | | ベクター | pBT3-SUC | | Cub-LexA-VP16 の位置 | 目的タンパク質の C 末端 | | S. cerevisiae インベルターゼ（SUC）遺伝子由来の N 末端 Type I シグナル配列を目的タンパク質の N 末端に付加します。哺乳類シグナル配列は酵母では認識されない場合があるため，目的タンパク質のシグナル配列を除いた cDNA をクローニングして下さい。 | Type II 膜内在性タンパク質 | 方向性 | N 末端：細胞質内 | C 末端：粗面小胞体内腔または細胞質内 | | ベクター | pBT3-N または pBT3-STE | | Cub-LexA-VP16 の位置 | 目的タンパク質の N 末端（pBT3-N），C 末端（pT3-STE） | | 目的タンパク質の N 末端，C 末端双方が細胞質内で発現している場合は，pBT3-N，pBT3-STE の双方にクローニングして，スクリーニングを行うことをお勧めします。 | G タンパク質共役レセプター（GPCR） | 方向性 | N 末端：粗面小胞体内腔 | C 末端：細胞質内 | | ベクター | pBT3-SUC または pBT3-STE | | Cub-LexA-VP16 の位置 | 目的タンパク質の N 末端（pBT3-SUC），C 末端（pBT3-STE） | | GPCR は N 末端に切断性シグナル配列を有する場合があります。目的の GPCR がシグナル配列を有することが予測される場合は pBT3-SUC に，有さないことが予測される場合は pBT3-STE にクローニングすることをお勧めします。 | ※prey についてもタンパク質の性質に対応した 4 種類のベクターが含まれています。またキットに含まれるベクター単独でのご購入も可能です。詳細は当社テクニカルサポート（下記参照）までお問い合わせ下さい。 ■キット内容 - pBT3-N bait vector
- pBT3-C bait vector
- pBT3-SUC bait vector
- pBT3-STE bait vector
- pPR3-N prey/library vector
- pPR3-C prey/library vector
- pOst1-Nub Ⅰ control prey
- Y2H transformation kit
- pPR3-SUC prey/library vector
- pPR3-STE prey/library vector
- pTSU2-APP positive control bait
- pNubG-Fe65 positive control prey
- NMY51 yeast reporter strain
- HTX β -galactosidase assay kit
※酵母は凍結乾燥品で納品されますが，製品到着後直ちに YPAD プレートで培養し，保管してください。 | | Y2H Membrane Pairwise Interaction Kit
ご購入時のご注意 | | | | 営利団体・企業にご所属の方が本製品（#P01501DS）を購入される場合はライセンス契約の締結が必要となります。詳細は下記までお問い合わせ下さい。
| 受託・特注品業務担当
Tel.：03-5684-1645 Fax：03-5684-6539 | |
■価 格 | | | | Y2H Membrane Protein Kit
販売終了のご案内 | | | | | |
Y2H Membrane Pairwise Interaction Kit（#P01501DS）の旧バージョン製品 Y2H Membrane Protein Kit（#P01001DS）については，販売終了とさせていただきました。#P01501DS をご使用下さい。
| | | | | ■Y2H Protein System cDNA Library Y2H Protein System 用 cDNA ライブラリーです。Membrane Pairwise Interaction Kit と Transactivating Protein System のいずれにも使用可能です。 |
