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[掲載日情報:2017/09/01 現在]

TREVIGEN社 CometAssay KitについてのFAQ

TREVIGEN社 CometAssay KitについてのFAQ

Q CometAssay(#4250-050-K)は固形組織でも使用できますか?使用できるのであれば,どのようにするのでしょうか?

A

組織より調製した細胞懸濁液にすることでCometAssayに使用できます。

プロトコルガイドライン

1. 組織小片を1~2 mlの冷HBSS / 20 mM EDTAと混合する。

2. 組織を細分化する。

3. 5~10μlの細胞懸濁液と75μlの溶解させた低融点アガロースを混合する。

細胞濃度や解離が十分行われているかを調べるために,一部の細胞を低融点アガロースではなくPBSで希釈し,顕微鏡で観察して下さい。

また他にも,組織小片をトリプシンで15分処理し,血清入りHBSSあるいは冷PBSで洗浄し,シリンジやニードルで機械的に分離する方法があります。

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Q SYBR Greenをセットする最適なフィルターは何ですか?

A

SYBR Greenの最大励起波長と蛍光波長は,それぞれ495 nmと521 nmです。フルオレセインフィルターをお勧めします。

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Q コメットアッセイの評価に利用できる画像解析ツールは何ですか?

A

コメットアッセイ用に設計された市販のPCソフトウェアーComet Assay Ⅳがあります。こちらからダウンロードでき,30日間無料で使用することができます。Comet Assay Ⅳには主要な測定パラメーターが含まれており,非常に高度なシステムです。

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Q SYBR Greenをセットする最適なフィルターは何ですか?

A

SYBR Greenの最大励起波長と蛍光波長は,それぞれ495 nmと521 nmです。フルオレセインフィルターをお勧めします。

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Q Electrophoresis bufferのpHの重要性は何ですか?

A

pH12.1では既に存在する損傷しか観察されませんが,pH12.5~13ではアルカリに不安定なDNA付加体が損傷します。CometAssayやFLARE Assayでは,観察されるDNA損傷がpH13で最大になります。

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Q 接着細胞で,予想よりもネガティブコントロールのDNAダメージが大きくなってしまいます。

A

トリプシン処理は,2%の冷トリプシンで30分間行って下さい。細胞にダメージを与えないよう,200×g以下のスピードで10分間遠心して下さい。トリプシンの代わりに,冷EDTA(2 mM)を使用することもできます。

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Q CometAssayへの光の影響はありますか?

A

サンプルは研究室の通常の蛍光灯下で扱うことができますが,溶解処理やアルカリ処理による巻き戻しステップは暗所で行って下さい。電気泳動は通常通り,蛍光灯下で行えます。

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Q CometSlide(#4250-050-03)はどれくらい保存できますか?

A

染色前の場合,乾燥剤と共に保存したスライドは長期間(数ヶ月)保存できます。CometAssay Silver Staining Kitを使うと,スライドを半永久的に保存でき,標準的な光学顕微鏡で観察することができます。

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Q アルカリ処理による巻き戻しとアルカリ電気泳動を同じpHで行うと,何か問題がありますか?

A

アルカリ処理による巻き戻しとアルカリ電気泳動は同じpH>13の条件で行えます。

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Q CometAssayを使ってアポトーシス細胞とネクローシス細胞を区別することはできますか?

A

はい。以下の二つの論文では,コメットアッセイを用いてアポトーシス細胞とネクローシス細胞を区別している結果が示されています。

Fairbairn, D.W., et al., Scanning, 18 (6), 407~416 (1996).

Singh, N. P., et al., Esp. Cell Res., 256 (1), 328~337 (2000).

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Q CometSlide(#4250-050-03)でカバースリップを使用しなければなりませんか?

A

Trevigen CometSlideは,カバースリップがアガロースを引き上げたり,サンプルを傷つけないようにするために,カバースリップなしで使用できるように設計されています。

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Q Anti-fade solutionとSYBR Greenを混合することはできますか?

A

Anti-fadeとSYBR Greenを混合すると沈殿が生じますので,ご使用直前に混ぜて下さい。

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Q 全血液に対してCometAssay(#4250-050-K)は使用できますか?

A

全血液に対してのご使用は,お勧めできません。ヘモグロビンはDNAを損傷させる恐れがあるため,サンプル調製は必ず行って下さい。また,血液の主成分である赤血球細胞はゲノムDNAなどが存在する核を持たないため,CometAssayの使用は適切ではないと考えられます。

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Q 時間が足りず,アッセイを終わらせることができません。中断して次の日に再開することはできますか?

A

染色以外のステップは,CometAssayの全工程を終わらせる必要があります。染色直前のステップなら,乾燥剤を同封することでサンプルを室温で保存することができます。

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Q ポジティブコントロールのコメットテイルが予想していたよりも短かったのですが?

A

電気泳動の時間を検討して下さい。推奨する時間は20分から40分です。

細胞の溶解処理を確認して下さい。Lysis Solutionは使用前に冷やして下さい。Lysis solutionは4℃で長い間保存すると沈殿することがあります。

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Q ハイスループットコメットスライド(CometSlide HT #4252-200-01)には20サンプル用のwellがありますが,全てのwellを使っていなければ,再利用できるでしょうか?

A

スライドはアガロースを結合させるための特別なコーティングがされており,再利用のために洗浄すると傷をつける恐れがあるため,お勧めできません。

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Q CometAssayを行う前に,植物細胞の細胞壁を除くためのプロトコールはありますか?

A

Comet assayグループウェブサイトでは,植物細胞を用いたコメットアッセイのリファレンスやプロトコールを提供しています。

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Q CometAssay Silver Staining Kitプロトコールは2 wellスライド用に考案されていますが,20 wellスライドでは各wellへの使用量を100μlから減らすことはできますか?

A

はい。各Solutionを50μlに減らすことができます。

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Q 赤血球細胞以外の血液細胞における酸化ストレスの測定にCometAssayを使用している情報または文献はありますか?

A

はい。以下の論文では,コメットアッセイを用いて赤血球細胞以外の血液細胞における酸化ストレスを測定した結果が示されています。

Sardas S., et al., Mutat. Res., 490 (2), 123~129 (2001).

Peter M., et al., American Journal of Clinical Nutrition, 76 (2), 303~310 (2002).

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Q SYBR Greenの退色を防ぐ方法はありますか?

A

1. SYBR Greenを添加した後,観察する前に遮光条件で乾燥させて下さい。染色がより安定し,サンプル中のDNA量に比例します。

2. 最初の塗布を洗浄せずにSYBR Green溶液を更にアプライして下さい。

3. 顕微鏡の蛍光灯に長時間曝すのは避けて下さい。

4. Anti-fade溶液を使用して下さい。p-Phenylenediamine dihydrochloride 500 mgと1X PBS 4.5 mlを50 mlチューブで混合し,10 N NaOHを溶液のpHが7.5-8.0に達するまで撹拌しながら約400μl添加して下さい。1X PBSを溶液の量が5 mlになるように添加し,更に45 mlのグリセロールを加えます。混合液をボルテックスし,作製した溶液を各サンプルあたり10μlずつ添加し,カバースリップでサンプルをカバーします。マニュキア液をカバースリップの密封に使うこともできます。スライドの再染色はお勧めできません。Anti-fade溶液は-20℃で1ヶ月保存できます。溶液は徐々に暗い色になるでしょう。

5. βメルカプトエタノール(1 mM)を希釈した色素に添加して下さい。

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Q ZEISS Axioplan/Axiovert顕微鏡はCometSlideの観察に使用できますか?

A

はい。ZEISS Axioplan/Axiovert 顕微鏡でCometSlideを観察することができます。

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Q 電気泳動に使用できる市販の水平ゲル電気泳動槽はありますか?

A

Comet Assay Electrophoresis System(#4250-050-ES)をお勧めします。従来のスラブ・ゲル電気泳動槽は,コメットアッセイのばらつきとなる要因を全て除くことができない設計となっており,使用できるものの,一貫性のある結果を得るには,自分で最適化をしなければなりませんでした。Comet Assay Electrophoresis Systemは,Comet Assay Kitに最適化してあるため,再現性の高い結果を得ることができます。

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