Atlas Antibodies社 標準免疫組織染色プロトコール(モノクローナル抗体用)
掲載日情報：2018/03/06 現在Webページ番号：6690
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Atlas Antibodies社 標準免疫組織染色プロトコール(モノクローナル抗体用)
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Atlas Antibodies社では、マウスモノクローナル抗体も販売しております。
モノクローナル抗体の製造に利用される組換え体タンパク質抗原は、同社のポリクローナル抗体と同じ独自の手法を用いて選別されています。モノクローナル抗体の製造過程では、独自の配列領域の選別および、適用の検証において顕著なパフォーマンスを示すクローンの選別を組み合わせて行っています。現在同社より販売されているモノクローナル抗体は、免疫組織染色およびウエスタンブロットで検証されています。
1脱パラフィン操作
4μm厚のパラフィン切片を50℃で一晩ベーキングする
↓
脱パラフィンをキシレンで行い,さらにエタノールから蒸留水へ段階的に親水化させる。
なお内在性ペルオキシダーゼのブロッキングは,親水化の過程において0.3%の過酸化水素水を含む95%エタノール中で5分間行う。
2標準抗原賦活化操作
標準的な抗原賦活化は加熱による方法（Heat Induced Epitope Retrieval;HIER）をpH6の賦活化バッファー（弊社ではLab Vision社 #AP-9003-125等を取り扱っております）中で行います。
圧力釜は,Biocare Medical社のDecloaking Chamberを使用します。
Tissue Micro Array slideを圧力釜中で125℃,4分間賦活化バッファー内に浸して行い、完了後は90℃になるまで静置します。全ての操作はおよそ45分程度です。
3染色操作
- 染色はLab Vision社 Autostainer480により行っています。
- すべてのインキュベーションは室温条件下で行っています。
- Ultra V Block, Primary Antibody Enhancer, 標識ポリマー, DAB溶液はLab Vision社UltraVision LP Detection System（弊社では #TL-015-HD等を取り扱っております）を使用しています。
- 1.スライドを洗浄バッファーで洗う。
- 2.Ultra V Blockにて5分間インキュベーション
- 3.スライドを洗浄バッファーで洗う（2回）
- 4.一次抗体を滴下し30分間インキュベーション
- 5.スライドを洗浄バッファーで洗う（3回）
- 6.Primary Antibody Enhancerを滴下し20分間インキュベーション
- 7.スライドを洗浄バッファーで洗う（2回）
- 8.標識ポリマー（弊社ではLab Vision社 #TL-015-HD等を取り扱っております）を滴下し30分間インキュベーション
- 9.スライドを洗浄バッファーで洗う（2回）
- 10.DAB溶液を滴下し,常温で5分間反応させる
- 11.スライドを洗浄バッファーで洗う（2回）
- 12.DAB溶液を滴下し,常温で5分間反応させる
- 13.蒸留水で洗浄
- 14.ヘマトキシリン溶液で5分間対比染色
- 15.水道水で5分間洗浄
- 16.飽和炭酸リチウム水溶液を6倍希釈した水溶液で1分間洗浄
- 17.水道水で5分間洗浄
- 18.段階的なエタノールティシュークリアで脱水・透徹を行う
- 19.封入する
4他の抗原賦活化法
- いくつかの抗体についてはデータシート・Human Protein Atlasポータルサイトに,別の方法で抗原賦活化を行うよう記載されている場合もあります。
- タンパク質分解酵素を用いた方法（Proteinase K溶液中にて10分間行う）
- 加熱による方法（pH9の抗原賦活化バッファーを用いてHIERを行う）
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