細胞培養液中の過酸化水素（H₂O₂）濃度測定キット Hydrogen Peroxide Cell-Based Assay Kit

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■試薬の調製

1. 超純水100 mlにCell-Based Assay Buffer Tabletを溶解する。

2. 超純水にCell-Based Assay Hydrogen Peroxide Standardを加えて1：1,000倍希釈液を調製する。
※ H₂O₂は不安定のため、H₂O₂保存溶液は使用前に調製して下さい。

3. 石英キュベットに調製したH₂O₂保存溶液を加えて、240 nmの吸光度を測定する。濃度（M）を、吸光度×希釈率／43.6により決定する。

算出したH₂O₂保存溶液の濃度に基づいて、希釈により1 mMのH₂O₂（×100 Working solution）を調製し、プロトコルに従って段階希釈（10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0μM）する。

4. Cell-based catalase assay catalase 2 mgをAssay buffer 500μl（96 wellキットの場合）に溶解し、Catalase solutionを調製する。

5. Cell-Based assay hydrogen peroxide detector ADHP 100μlおよびCell-based horseradish 100μlをAssay buffer 800μlに溶解し、Enzyme reaction solutionを調製する。このEnzyme reaction solutionは氷上で調製後最大1時間安定です。

■測定

1. 96-wellプレートに無血清培地100μl中10⁴～10⁵ cells/wellの細胞を播種する。必要に応じて、薬剤またはビークルコントロールを培地に添加する。コントロールは、細胞を播種していない実験用化合物を含んだ培地を用いる。
※ カタラーゼのコントロールウェルを別に設定して下さい。
※ 測定は、トリプリケート（同一条件で3点の測定）で実施することをお勧めします。

2. 細胞を37℃で24～48時間または設定した実験条件に従って培養する。96-well培養用プレートを400×gで5分間遠心分離する。

3. 各ウェルから上清80μlを取り出し、新しい96 well黒色プレートに添加する。各ウェルにAssay buffer（試料の活性測定用）またはCatalase solution（特異性試験用）10μlを添加する。

4. 各ウェルにEnzyme reaction solution 10μlを添加する。

5. 5分以内に、蛍光強度（励起 530 nm／蛍光 590 nm）を測定する。