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System Biosciences, LLC
システムバイオサイエンス / System Biosciences, LLC
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[掲載日情報:2017/12/05 現在]

エクソソームのFCM解析用蛍光標識キット ExoFlow-ONE EV Labeling Kit for Flow Cytometry

Exosome(エキソソーム,エクソソーム)特集バナー

エクソソームなどの細胞外小胞体(EV)の膜内タンパク質を蛍光標識するキットです。エクソソームのフローサイトメトリー解析に有用です。

特長

  • 本キットで使用の蛍光色素は,膜透過性で,かつエクソソーム内存在時に活性化されます。バッファー中に遊離した未反応色素はバックグラウンドとして検出されません。
  • 1キットで,タンパク質量200~500μg相当のエクソソームを25回標識できます。
  • 5色の蛍光色素のキットがあります。
  • キットに含まれるSize reference beadsは,生体内粒子と同様の屈折率と散乱パターンを示します。そのため,粒子サイズのより正確な測定(図3参照)や,測定装置の感度・解像度の検討に有用です。
  • 通常のフローサイトメーターによる解析の他に,イメージングフローサイトメーターを用いた解析にも使用できます(図4参照)。
  • 膜表面タンパク質に対する蛍光標識抗体と組み合わせた解析も可能です(図5参照)。

キットで用いている蛍光色素の波長

蛍光色素名 励起波長 蛍光波長 推奨するレーザー光波長
Topaz Blue 403 nm 454 nm 405 nm
Emerald Green 511 nm 525 nm 488 nm
Citrine Yellow 542 nm 556 nm 532 nm
Ruby Red 573 nm 588 nm 561 nm
Garnet Far Red 628 nm 643 nm 633 nm

Size reference beadsの仕様

粒径(nm) 粒子の概数
(個/μl)
488 nmの励起光により生じる蛍光 屈折率(n)
110 8,000 緑色 1.59
180 23,000 なし 1.43
240 10,000
300 9,000
500 3,600 緑色 1.59
590 2,700 なし 1.43
880 3,900
1,300 3,400

測定例

Size reference beads

図1:Size reference beadsを測定した例
BD LSRⅡ instrument(BD社)を用いて,FITCとSSC(側方散乱光)のチャンネルで検出した。蛍光標識されたビーズ(110,500 nm)を,他と識別することができる。

各色に標識

図2:各色に標識したEV混合物を測定した例
本キットで各色(Citrine Yellow,Ruby Red,Garnet Far Red)に標識および未標識のHEK293T由来の細胞外小胞体(EV)の混合物を,BD LSRⅡ instrument(BD社)を用いて,PEとAlexa700のチャンネルで検出した。それぞれのシグナルがきれいに分離されている。

バックグラウンド

図3:バックグラウンドからの識別
本キットでEmerald Greenに標識(B)および未標識(A)のヒト血清由来の細胞外小胞体(EV)を,BD LSRⅡ instrument(BD社)を用いて,FITCとSSC(側方散乱光)のチャンネルで検出した。その際に,Size reference beadsをベースとして,≧110 nmにサイズゲートを設定した。本キットで標識した試料では,バックグラウンドからきれいに分離され,検出することができる。

イメージングフローサイトメーター

図4:イメージングフローサイトメーターを用いた高解像度解析の例
HEK293T由来の細胞外小胞体(EV)をストレプトアビジンで標識後,ビオチン標識Atto 488(上段),Garnet Far Redキット(中段),その双方(下段)で処理をした。その後,Amnis ImageStreamX MarkⅡ Flow Cytometer(Merck社)で検出を行った。それぞれの蛍光色素の蛍光波長に相当するチャンネルでシグナルを検出できたが,明視野および散乱チャンネルの検出限界以下であったことが分かる。

蛍光抗体

図5:蛍光標識抗体と組み合わせた解析の例
マウス由来の細胞外小胞体(EV)をEmerald Greenキットと蛍光標識抗体で標識後,解析を行った。
A:APC標識抗細胞接着タンパク質と併用した場合
右図(Stained)で,Emerald Green軸において2つの集団が確認できるが,いずれの集団も細胞接着タンパク質を発現していることをAPC軸から確認できる。
B:PE標識抗マクロファージ膜タンパク質抗体と併用した場合
右図(Stained)で,Emerald Green軸において2つの集団が確認できるが,いずれの集団もマクロファージ膜タンパク質を発現していないことをPE軸から確認できる。
これらの結果から,本キットと蛍光標識抗体を組み合わせた解析により,EVの亜集団を容易に検出できることが分かった。

操作方法概略

【Size reference beadsの準備】

Size reference beadsの滴下ボトルを使用直前に数回反転させて撹拌した後,あらかじめ0.02μmフィルター処理した500μlの1×PBSに1滴加え,混合する。

【エクソソームの蛍光標識】

  1. あらかじめ0.02μmフィルター処理した500μlの1×PBSに,タンパク質量200~500μg相当のエクソソームを再懸濁させる。
  2. 懸濁させたエクソソームに1μlのExoFlow-ONE dyeを加え,撹拌しながら37℃で20分間インキュベートする。
  3. フローサイトメーターによる測定を行う。

【オプション:未反応色素の除去】

本キットで使用の蛍光色素は,膜透過性で,かつエクソソーム内存在時に活性化されます。バッファー中に遊離した未反応色素はバックグラウンドとして検出されませんが,未反応色素の除去が必要な場合は,以下のプロトコルに従って下さい。

  1. 標識反応液に167μlのExoQuick-TC reagentを加え,4℃で2時間インキュベートする。
  2. 10,000 rpmで10分間遠心分離を行い,上清を注意深く取り除く。
  3. あらかじめ0.02μmフィルター処理した500μlの1×PBSに再懸濁させた後,フローサイトメーターによる測定を行う。

キット内容

  • ExoFlow-ONE dye
  • Size reference beads
  • ExoQuick-TC reagent

価格

[在庫・価格 : 2018年01月19日 10時50分 現在]
メーカー 商品コード 商品名 包装 価格 在庫 リスト
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EXOF400A-1

ExoFlow-ONE EV Labeling Kit for Flow Cytometry(Topaz Blue)

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ExoFlow-ONE EV Labeling Kit for Flow Cytometry(Emerald Green)

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ExoFlow-ONE EV Labeling Kit for Flow Cytometry(Ruby Red)

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ExoFlow-ONE EV Labeling Kit for Flow Cytometry(Garnet Far Red)

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